嗜吞噬细胞无形体临床分离株 NCH-1 的全基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of the Anaplasma phagocytophilum clinical isolate NCH-1

　　

摘要

无形体吞噬细胞嗜血体是一种专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，是人类粒细胞无形体病的病原体。A. phagocytophilum的基因组测序历来通过短读长平台完成。我们优化的细菌分离方案结合Nanopore测序，产出了NCH-1菌株的一条完整的闭环环状A. phagocytophilum染色体，全长1,481,805 bp。

公告

无形体吞噬细胞嗜血体是人类粒细胞无形体病的病原体，也是一种蜱媒病原体，为美国报告最多的立克次体病之一（1–4）。NCH-1于1994年从马萨诸塞州楠塔基特岛乡村医院的一名患者中分离，是广泛使用的实验室参考菌株（5）。A. phagocytophilum基因组高度重复（约13%），仅msp2/p44同源物即占约5%（6）。由于A. phagocytophilum的细胞内生活方式导致宿主DNA污染，基因组测序历来局限于短读长技术。加之基因组的重复结构，引发了对组装完整性和准确性的担忧（7）。通过开发改进的细菌分离方法并采用Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长测序，我们完成了A. phagocytophilumNCH-1菌株的完整基因组组装。

A. phagocytophilum在RF/6A脉络膜内皮细胞（ATCC CRL-1780）中培养维持（8）。感染后26小时从同步感染细胞中分离细菌（8）。收集含有自然释放细菌的培养基，通过2 μm滤膜过滤后，在20,000 × g、4°C条件下离心20分钟。沉淀的细菌重悬于1×汉克平衡盐溶液（HBSS：[Gibco]）中，使用S-4000超声波液体处理器（Misonix）进行短暂超声处理（10秒脉冲，30安培）以裂解宿主细胞核。在500 μL总体积中，用1× TURBO DNase缓冲液（Invitrogen）、6U TURBO DNase（Invitrogen）和50 μg/mL RNase A（Invitrogen）处理以去除宿主核酸，随后通过30% MD-76R密度垫在21,100 × g、4°C条件下离心45分钟进行纯化（9）。使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Promega）提取基因组DNA。裂解前，将细菌重悬于100 μL 1×磷酸盐缓冲液和6 mAU蛋白酶K（Invitrogen）中，于60°C孵育1小时。宿主DNA污染通过q-PCR和终点PCR评估（8）（图1）。将DNA（50 ng/μL；50 μL）提交给Eurofins Genomics进行Nanopore测序，使用其细菌基因组测序分析流程v1.0。文库使用V14连接测序试剂盒（ONT：SQK-LSK114）从未剪切、未大小选择的DNA制备，并在GridION R10.4.1流通池上测序。

图1

图1 A. phagocytophilum基因组分离用于后续ONT测序。（A和B）使用针对A. phagocytophilum（Ap）DNA纯度的引物进行q-PCR和终点PCR检测，针对Ap NCH-1菌株dnaK（5′-atggcggctgagcgtataatagg-3′，5′-ctaagtattcttcttgtcctcgtccttattaatctcc-3′）和宿主β-actin（5′–agatgacccagatcatgtttgagacct–3′，5′–tcgtagatgggcacagtgtgg–3′）基因。在A. phagocytophilum基因组提取之前，细菌分离经历三个步骤：将自然释放的细菌通过2 μm滤膜过滤，用TURBO DNase和RNase A处理完整细菌以降解宿主污染的DNA，随后进行A. phagocytophilum密度垫（30% MD-76R）纯化。在整个过程中多次取样以评估A. phagocytophilum基因组DNA的纯度。成功分离A. phagocytophilum基因组后，样品送交全基因组测序。

序列分析使用默认参数。碱基调用使用MinKNOW-v25.05.12配合Dorado完成。测序共产生168,303条原始读长，总计631,905,285 bp。FastQC-v0.12.1测定中位Phred质量为31（10）。使用Filtlong进行最小读长1,000 bp的质量过滤，随后用Rasusa下采样至180×目标覆盖度（11）。组装使用Flye-v2.9.6-b1802完成，并用Medaka-v2.2.0进行校正（12）。序列组装为1,481,805 bp的连续序列（QUAST N₅₀：1,481,805；L₅₀：1；L₉₀：1），GC含量为41.65%。CheckM-v1.0.13结合2015_01_16数据库预测基因组完整度为99.57%，污染率为5.21%（13）。使用Geneious（Dotmatics）de novo组装器确认环化，覆盖度范围为271×至516×，无结构缺口。PGAP-v6.11预测共1,163个基因，包括1,012个蛋白质编码基因、3个rRNA、37个tRNA、4个ncRNA和107个假基因（14）。与替代分离株组装相比，NCH-1（GCF_000964725.1）、HZ（GCF_000013125.1）和HGE1（GCF_000478425.1），OrthoANIu（CJ Bioscience）计算的平均核苷酸同一性分别为99.93%、99.92%和99.69%（15），大多数比对差异集中在连续序列边界和msp2/p44位点，强烈提示序列组装效力方面的错误或基因组构成差异。

致谢

本研究由NIAID/NIH F32博士后奖学金AI183749、弗吉尼亚公共大学博士后协会博士后独立研究奖（授予T.J.C.）以及NIAID/NIH R01 AI167857、R37 AI072683和R01 AI139072（授予J.A.C.）资助。