多通道自动化可编程液体交换系统实现超分辨显微镜高质量样品制备

《The Innovation》：Multi-channel automated programmable liquid exchange system enables high-quality sample preparation for super-resolution microscopy

　　

超分辨显微镜(SRM)的出现提升了对样品质量的需求，以在纳米尺度真实呈现细胞超微结构。对于依赖固定样品的SRM技术，免疫荧光(IF)标记是常用方法。然而传统手动IF制备劳动密集、耗时且高度依赖操作者，限制标准化与可重复性。研究人员报道了一种称为多通道自动化可编程液体交换系统(MAPLES)的紧凑、低成本装置，用于高质量IF样品制备。MAPLES集成双蠕动泵与多通道电磁阀，实现精确、温和的液体操作且试剂无交叉污染。配备可互换适配器，支持多种开放格式生物样品。系统具有高注射精度、低试剂残留和有效废液去除，适用于多步IF流程。MAPLES制备的IF样品在各种生物学背景下稳定保持超微结构完整性与保真度，满足随机光学重建显微镜(STORM)的严格要求。其灵活模块化设计可与显微镜集成，实现活细胞药物交换与原位STORM样品处理。综上，MAPLES为高质量样品制备提供了稳健、可及且通用的平台，推进SRM流程并支持多样扩展应用。

研究背景方面，过去二十年超分辨显微镜(SRM)突破衍射极限，但高分辨率成像要求高质量样品；固定样品类SRM如随机光学重建显微镜(STORM)常依赖免疫荧光(IF)标记。传统手动IF制备步骤多、耗时、劳动密集且高度依赖操作者技术与训练，导致样品质量不稳定，影响成像数据可重复性与可靠性。市面商用系统多面向高通量免疫组化，体积大、价格高；部分灌注系统存在共用管路导致试剂交叉污染风险；低成本自制系统也难以同时实现小型化、低成本、无交叉污染与多样品兼容。因此，学术实验室亟需紧凑、低成本、无污染且兼容开放样品的自动化IF制备平台。

该研究由L.P.构思，L.P.与B.W.设计装置，研究人员开发并验证MAPLES。结论是该装置可进行温和、精确、无交叉污染的液体处理，制备的IF样品满足STORM成像严格要求，并可与显微镜集成完成活细胞药物交换与原位超分辨样品处理。论文发表于《The Innovation》，意义在于为SRM工作流程提供可及、可扩展、可标准化的样品制备与在位实验平台。

主要关键技术方法上，研究人员采用计算机数控(CNC)加工定制件与市售件构建MAPLES，以双蠕动泵、8通道电磁阀和空气介导驱动实现多通道液体分配与废液抽吸；以LabVIEW编写可编程控制界面完成八通道顺序试剂处理；样本包括COS-7、U2OS、MDA-MB-231细胞及健康供者人红细胞，小鼠肾与心脏组织切片；超分辨成像使用商业STORM系统以647 nm或561 nm激发、405 nm激活，100 fps采集约40000帧并依算法重建，聚类分析用DBSCAN。

研究结果如下。

Framework of MAPLES：研究人员通过双蠕动泵、多通道电磁阀、一次性注射器与主动空气间隙策略构建仅1.6 kg、约19 cm×17 cm×7 cm的模块；设计12 mm盖玻片、25 mm盖玻片、共聚焦皿、标准载玻片四类适配器，盖玻片适配器配带孔盖防蒸发，限液环降低抗体用量至小于200 μL或小于300 μL，证明装置紧凑、开放样品兼容且可延长管路与显微镜集成。

Performance evaluation of MAPLES：研究人员测试注射精度、连续注射、死体积与废液残留。1 mL注射器在50 μL误差±10%、100 μL与200 μL误差±5%、500 μL约±3%；5 mL注射器连续十次500 μL误差±3%；1 mL注射器死体积9±2 μL至11±2 μL；适配器废液残留低于4%，三次漂洗后残留试剂浓度降至(4%)³=0.0064%，满足高信噪比(SNR)制备需求。

MAPLES for STORM super-resolution imaging sample preparation：研究人员用COS-7完成四色IF，用小鼠肾心组织15 h流程显示肾小球与心肌肌节结构；以人红细胞为脆弱模型，12次1000 μL/min漂洗无结构损伤，STORM下tropomodulin(TMOD)呈均匀簇、最近邻距离峰值约80 nm、二维自相关呈六方格；U2OS中Nup98与Nup62双色STORM显示核孔复合体环/月牙构型；COS-7中微管与线粒体、微管与内质网(ER)双色3D STORM解析出线粒体三维管状与微管ER接触位点，证明MAPLES样品具有纳米结构保真度。

MAPLES for live-cell treatment and subsequent in situ STORM sample preparation：研究人员用共聚焦皿适配器在MDA-MB-231中顺序加阻断液、一抗、洗液、二抗，活细胞下PD-L1由均质膜分布聚集成簇；同视野原位固定后STORM显示完整IgG二抗组每个簇闪烁事件127.4±45.6、簇密度0.6±0.2 clusters/μm²，非交联Fab二抗组为13.8±1.8与8.3±1.6 clusters/μm²，证明原位从动态到固定状态的可重复表征。

MAPLES for sequential drug exchange during live-cell calcium imaging and subsequent in situ STORM sample preparation：研究人员以COS-7负载Fluo-4 AM，用MAPLES顺序加thapsigargin(TG)、恢复胞外Ca²⁺、加2-aminoethoxydiphenyl borate，记录胞质Ca²⁺动态与store-operated calcium entry(SOCE)；在SOCE峰值时原位固定并对STIM1做IF与STORM，TG处理细胞基底膜STIM1 puncta密度与面积显著增加，对照细胞无明显puncta，实现同一细胞功能信号与纳米结构关联。

讨论部分总结：研究人员指出MAPLES以调速蠕动泵与小内径管路实现稳定低流精确控制，温和液体处理在脆弱红细胞多次洗涤后仍保持超微结构；高效废液抽吸使三次洗涤残留浓度达0.0064%，降低背景。相比泵阵列系统，MAPLES用双泵加电磁阀显著降复杂度、占地小、可多台并行且单台故障不影响其余。各试剂入独立一次性注射器并以空气驱动与主动空气间隙避免共用管路交叉污染。可互换适配器兼容盖玻片、共聚焦皿、载玻片，限液环将抗体用量压至小于200 μL，并支持一抗回收与7–12 μL残量，提升试剂利用与可持续性。装置还可直连显微镜完成原位sequential drug exchange与signaling研究。

结论部分翻译：为满足SRM中对高保真、高信噪比标准化样品制备的关键需求，研究人员报道MAPLES——一种紧凑、低成本、用于开放格式生物样品温和、精确且无污染液体处理的自动化系统。MAPLES以仅数个组件构成紧凑架构，用双蠕动泵与多通道电磁阀管理多试剂，消除类似多通道灌注系统与移液机器人的试剂携带污染。其可互换适配器兼容盖玻片、共聚焦皿与标准载玻片，以低成本一次性注射器与限液环降低抗体消耗并支持一抗回收。样品处理模块可直接与显微镜集成，实现原位sequential drug exchange与in situ STORM处理。总之，MAPLES以紧凑低成本、无污染、开放样品兼容、用户可编程与可扩展通量，提供高质量IF样品制备平台；其制备样品稳定保持纳米结构保真度与高信噪比，消除手动制备变异，满足SRM严格要求，并通过与显微镜直接集成实现药物交换与原位样品处理，使其成为高保真SRM免疫荧光制备与复杂药物干预研究的通用系统。