膜纳米管中肌球蛋白II非依赖性肌动蛋白丝收缩

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Myosin II–independent contraction of actin filaments in membrane nanotubes

　　

在丝状肌动蛋白基质中产生主动应力的能力是一个基本且进化上保守的过程，驱动细胞的运动和形态发生变化。由肌动蛋白聚合产生推力的机制已被充分理解，并已知可驱动基于片状伪足的运动以及丝状伪足的延伸。由肌球蛋白马达装饰的肌动蛋白丝也能产生收缩应力，如在细胞皮层或胞质分裂环中。在本文中，研究人员利用从轴突轴拉出的膜纳米管来研究肌动蛋白动力学和力产生。研究人员报告了管内肌动蛋白的周期性生长和回缩动力学，以及相关的收缩事件，这些事件产生持续的负载和失效循环。该收缩机制独立于肌球蛋白II马达蛋白发挥作用。此外，研究人员分析了管内肌动蛋白的动力学，包括在各种生化或遗传扰动条件下。通过将这些结果与物理建模相结合，研究人员认为由肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor, ADF/cofilin）蛋白结合在肌动蛋白丝上产生的应力可以解释这种周期性的负载-失效行为。

膜纳米管中肌球蛋白II非依赖性肌动蛋白丝收缩的论文解读

一、研究背景与问题

肌动蛋白丝是真核细胞产生力的核心元件，其聚合可产生推力，与分子马达蛋白结合可产生拉力，并通过动态交联蛋白介导滑动产生收缩力。膜纳米管（如丝状伪足、 tunneling nanotubes等）是细胞运动、环境感知、信号传导和细胞间运输所依赖的动态结构，其形成与稳定性通常取决于肌动蛋白丝的组装及其调节蛋白。既往研究已明确聚合驱动的纳米管延伸，但纳米管内部肌动蛋白动态如何调控，以及这种调控如何关联到拉力产生，仍不清楚。传统观点认为收缩力主要由肌球蛋白II马达蛋白驱动，然而已有实验和理论表明，通过交联、成束和肌动蛋白丝周转也可能在不依赖肌球蛋白马达的情况下产生收缩力。因此，一个关键问题是：纳米管中的收缩力是否必须依赖肌球蛋白II？为了解答这一问题，研究人员采用光学镊子从鸡胚背根神经节神经元轴突拉出膜纳米管，并结合生化遗传扰动与物理模型，系统研究了管内肌动蛋白动态与力产生机制。该论文发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》上。

二、研究内容与主要结论

研究人员发现，从轴突拉出的膜纳米管中，肌动蛋白丝表现出持续的、周期性的负载-失效循环：力缓慢上升将珠子拉向轴突，随后迅速塌缩至基线。这一循环动作不依赖肌球蛋白II和肌球蛋白V，但严格依赖ATP和动态肌动蛋白聚合。荧光成像显示，管内肌动蛋白经历周期性的生长与回缩，回缩速度在尖端最大、基部趋近于零，并常伴随螺旋屈曲。进一步的遗传扰动表明，肌动蛋白解聚因子ADF/cofilin家族参与该过程。将实验结果与随机收缩模型相结合，研究人员定量重现了力峰值与破裂时间的概率分布，提出ADF/cofilin结合诱导肌动蛋白丝收缩的机制。该机制无需马达蛋白，为纳米管中收缩力的产生提供了新解释，对理解丝状伪足和tunneling nanotubes的动态调控具有重要意义。

三、主要技术方法

研究使用自建光学镊子从鸡胚背根神经节神经元轴突拉出膜纳米管并记录力；荧光成像使用LifeAct-mCherry或pCAG-Actin-GFP标记肌动蛋白，pCAG-ADF-RFP标记ADF。药物扰动包括：肌球蛋白II抑制剂Blebbistatin、Rho激酶抑制剂Y-27632、肌球蛋白V阻断剂MyoVin-1、肌动蛋白稳定剂Jasplakinolide、肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin A、formin抑制剂SMIFH2、Arp2/3抑制剂CK666、微管解聚剂Nocodazole，以及ATP耗竭处理。遗传操作包括：表达失活型ADF（S3E）和激活型ADF（S3A），以及siRNA敲低ADF。理论方面，采用基于Gillespie算法的随机模型模拟多根肌动蛋白丝与纳米管尖端结合/脱离及ADF/cofilin介导的丝收缩过程。样本包括鸡胚DRG神经元和鸡原代成纤维细胞。

四、研究结果

（一）提取的纳米管表现出负载-失效循环

使用光学镊子从轴突拉出膜纳米管后，约50%以上的管子在一分钟内出现重复的力峰（主动力峰），力缓慢升高将珠子拉向轴突，随后快速回落至基线。破裂时间（t_rupt）和峰值力（f_peak）的分布呈现特征性：小值处存在峰值，大值处呈指数衰减。力塌缩呈双指数衰减，相邻负载-失效事件的等待时间服从平均约30秒的指数分布。

（二）肌动蛋白丝表现出生长与回缩循环

通过荧光成像记录管内肌动蛋白，发现其表现出周期性生长和回缩。生长阶段，荧光强度从基部到尖端单调递减，说明多根丝侵入且密度向尖端降低。回缩阶段，局部荧光增强区出现并漂向基部，尖端方向几乎无荧光，提示肌动蛋白以完整聚合物形式回缩而非在线解聚。当荧光强度连续跨越整个管时力升高，出现断裂时不连续时力突降。回缩期常观察到螺旋屈曲，屈曲间距在长短管中相似。

（三）肌动蛋白动态是力循环的必要条件，但分子马达并非必需

药物实验显示，肌球蛋白II抑制剂Blebbistatin、Rho激酶抑制剂Y-27632、肌球蛋白V阻断剂MyoVin-1均不改变负载-失效行为；而ATP耗竭、Jasplakinolide稳定肌动蛋白、Latrunculin A抑制聚合则完全消除力循环。抑制formin（SMIFH2）或Arp2/3（CK666）也不影响力峰。破坏微管（Nocodazole处理或在成纤维细胞中完全解体微管）仍能观察到力动态，排除了微管马达（kinesin/dynein）牵引的贡献。因此，力产生依赖动态肌动蛋白丝，但不依赖肌球蛋白II、V及微管马达。

（四）ADF/cofilin在肌动蛋白介导的力循环中发挥作用

ADF（RFP标记）与肌动蛋白（GFP标记）在纳米管中共定位且动态高度相关。表达失活型ADF（S3E）与内源ADF竞争后，峰值力显著降低，峰值持续时间显著延长，有些事件可持续约250秒并保持饱和力；表达激活型ADF（S3A）则与对照无显著差异。这表明内源ADF活性已趋饱和，且ADF结合产生的应力是力峰的关键来源。

（五）随机收缩模型定量重现负载-失效行为

研究人员建立多丝随机模型：肌动蛋白丝从管基部长出，可附着于尖端，ADF/cofilin以速率k_on结合单体并使其无应力长度缩短δ?，同时以k_off解离；丝与尖端之间通过弹簧连接。模拟结果显示，单根丝模型（即使破裂速率依赖力）无法解释实验分布，而允许最多3根丝同时附着（n_fil=3），且每根丝最大力f_max=4.3 pN、力产生速率k_b=0.25 s^-1、附着与脱离速率k_a=k_r=0.25 s^-1时，理论模拟的f_peak和t_rupt分布与实验高度吻合，并能再现力的部分突降、斜率变化和饱和等特征。

五、讨论与结论

讨论部分将本机制与既有丝状伪足收缩模型比较：通过牵引力显微镜观察到的丝状伪足负载-失效循环被归因于肌球蛋白II在基部拉动，而本实验多种药物排除了肌球蛋白II的作用；皮层肌动蛋白逆行流耦合模型也被本研究的荧光数据否定，因为回缩时基部速度近零；end-tracking蛋白如formin虽可产生力，但formin抑制不消除力峰；膜结合的不典型肌球蛋白如myosin X估计产生的力（约10^-2 pN/马达）远低于观察到的数pN，因此马达驱动可能性低。

基于ADF与肌动蛋白共定位、失活ADF延长力峰等现象，研究人员提出ADF/cofilin介导的收缩假说：ADF/cofilin结合肌动蛋白丝可诱导扭转应力，使肌动蛋白螺距减少约25%，伴随纵向收缩应变；当丝两端受约束于膜管基底和尖端之间时，收缩性应变产生拉力。当丝因过度变形而断裂时力塌缩，随后新聚合的ATP-肌动蛋白经水解和ADF再结合进入下一轮循环。

结论部分翻译如下：

总之，研究人员证明了从轴突拉出的膜纳米管中存在肌球蛋白II非依赖的、基于肌动蛋白的周期性收缩性。轴突因缺乏可干扰力信号的显著运动而成为定量力分析的便利系统，这使研究人员能够比较实验与理论获得的负载-失效响应的统计性质。本研究提出的基于ADF/cofilin的机制可进一步通过重组肌动蛋白与cofilin的光学镊子实验在体外验证。此类机制在真实丝状伪足动态中的参与程度也是未来探索的方向。