《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Cryo-EM structure of TGFBIp fibrils driven by a corneal dystrophy–linked mutation enables design of peptide inhibitors of aggregation
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理解蛋白质聚集性疾病分子基础对开发治疗策略至关重要。一类此类疾病为角膜营养不良（corneal dystrophy），其遗传与病理均与转化生长因子β诱导蛋白（transforming growth factor β–induced protein, TGFBI
理解蛋白质聚集性疾病分子基础对开发治疗策略至关重要。一类此类疾病为角膜营养不良（corneal dystrophy），其遗传与病理均与转化生长因子β诱导蛋白（transforming growth factor β–induced protein, TGFBIp）相关。迄今TGFBIp聚集体分子结构研究不足，且无药物治疗。研究人员描述了由角膜营养不良相关突变V624M诱导的TGFBIp FAS1-4结构域形成纤维丝的不寻常“由内向外（inside-out）”冷冻电镜（cryogenic-electron microscopy, cryo-EM）结构。该工作为如何利用蛋白质纤维高分辨率结构设计端帽（end-capping）肽抑制剂提供框架，该方法或可推广至其他蛋白质聚集疾病。
角膜营养不良为异质性疾病群，临床表现为进行性角膜混浊与视力减退。部分角膜营养不良与TGFBIp常染色体显性突变相关，并以分子结构未知的胞外淀粉样（amyloid）沉积为特征。研究人员测定了携带角膜营养不良相关突变V624M的TGFBIp FAS1-4结构域淀粉样纤维的cryo-EM结构。纤维核（fibril core）为L569至N609，含患者角膜沉积富集的Y571-R588段，形成具内部溶剂通道的对称原纤维（protofilament）。基于该结构，研究人员设计结合纤维末端以阻断延长的肽抑制剂，靶向对称原纤维的不均等生长。G1与H4抑制剂经硫代黄素T（Thioflavin T, ThT）、可溶性分级与电镜评估，呈浓度依赖性地降低TGFBIp FAS1-4聚集。该工作阐明纤维结构如何指导理性抑制剂设计，并提示以蛋白质聚集体为靶点可作为角膜及眼病的治疗思路。
研究背景方面，角膜营养不良为遗传性、双侧、非炎性眼病，临床以角膜混浊或透明性丧失为表现，美国患病率约900/百万人。目前唯一治疗为角膜移植（keratoplasty），但受供体角膜限制，存在移植物失败、病毒感染等并发症，且术后5至20年常复发，因此亟需非移植替代疗法。TGFBI基因为广泛表达的人源基因，其编码的TGFBIp是角膜基质中第二丰富蛋白，由N端CROPT结构域及四个同源fasciclin 1结构域（FAS1-1至FAS1-4）组成；多数生理状态下于第657位残基截断。TGFBIp与整合素、胶原、纤连蛋白相互作用，参与黏附、迁移、血管生成、创伤修复与炎症，但精确功能未明。1990年代末发现TGFBI常染色体显性突变可致多种角膜营养不良，目前已收录74个突变，其中62个位于FAS1-4；不同突变对应不同混浊表型、起病与疾病类型，如经典型颗粒状角膜营养不良（lattice corneal dystrophy, LCD）、颗粒状角膜营养不良（granular corneal dystrophy, GCD）、Reis-Bücklers与Thiel-Behnke角膜营养不良。LCD患者角膜淀粉样沉积质谱分析显示Y571-R588段富集，该段在体外可形成蛋白酶抗性淀粉样纤维，但患者来源聚集体因组织稀缺未被结构表征；既往重组TGFBIp纤维研究仅用短肽而非球状FAS1-4。因此研究人员开展重组FAS1-4 V624M纤维的cryo-EM结构解析与结构导向抑制剂设计。
主要关键技术方法方面，研究人员使用重组TGFBIp FAS1-4（残基503至657）及563至657构建体，以及携带LCD相关突变V624M、A546D、G623R、H626R的蛋白，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4中间歇振荡诱导聚集；以ThT动力学监测纤维形成，以负染透射电镜（negative stain transmission electron microscopy, nsTEM）观察形貌，对具扭转形貌的FAS1-4 V624M纤维用cryo-EM与螺旋重建（helical reconstruction）解析3.2 ?纤维核结构；基于结构以Rosetta优化连接肽、设计G1与H4端帽肽，并用ThT、可溶性分级、nsTEM及成核种子（seed）实验评估抑制效果，样本为重组蛋白而非患者队列。
研究结果方面，TGFBIp 563-657 Proteins Form Ribbon-Like Fibrils Readily。研究人员将TGFBIp 563-657及FAS1-4蛋白纯化后于PBS中30 μM诱导聚集，ThT显示G623R、V624M、H626R及野生型（wild type, WT）563-657在约16小时完成生长，nsTEM见大量纤维；但563-657 WT与V624M为无规则扭转的带状纤维，不适于螺旋重建。
TGFBIp FAS1-4 V624M Proteins Form Ribbon-Like and Twisting Fibrils。FAS1-4全长结构域需LCD突变才会聚集，WT 7天不聚；V624M、A546D、H626R约3天达平台。nsTEM示突变纤维稀疏；仅V624M经0.25%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）处理可用于cryo-EM，图像中以带状纤维为主，少数具714 ?交叉与C2对称的扭转纤维，并据同纤维上两类颗粒推断带状与扭转纤维可能同构。
FAS1-4 V624M Amyloid Fibril Core Structure。研究人员解析3.2 ?扭转纤维核，螺旋扭角?1.21°、升距4.8 ?；155个残基中L569至N609共41个残基建核，呈Ω形折叠，含Y571-R588，V624M不在核内。每条原纤维有内部溶剂腔，原纤维二聚界面为L592疏水同源拉链（homozipper）；K590、D595、V599附近弱密度可能为C端模糊外套（fuzzy coat）。原纤维含β1至β6六条β链，其中β3、β5、β6在天然FAS1-4亦为β链；H572-E576-G574羰基、R588-Q593、K590-D595、D575-K602-N603等静电作用稳定折叠。腔内8/13残基为极性/带电，疏水β链沿轴被上下残基部分掩埋；原子溶剂化标准自由能每蛋白?18.0 kcal/mol，稳定性介于致病淀粉样与功能淀粉样之间。
FAS1-4 V624M Fibril Attachments of Unknown Identity。cryo-EM见纤维有球状附着物，间距约62 ?；以20 ?分辨率上限做二维分类并用62 ?升距精修得15 ?图，因异质/不规则未能鉴定；体系仅含纯化FAS1-4，故附着物最可能来自FAS1-4，AlphaFold3推测为核外N端或单体/片段螺旋束，但身份未定并可能影响纤维结构。
Structure-Based Design of Peptide Inhibitors。研究人员取纤维界面V587-D595两段重复，用Rosetta优化连接肽并加色氨酸拉链（tryptophan zipper, TrpZip）防自聚，得G1与H4。70 μM V624M体系中，G1/H4浓度依赖降低ThT斜率与平台、dot blot沉淀量与nsTEM纤维量；乱序肽无抑制，EGCG为阳性对照。G1/H4本身不聚集，需10倍摩尔过量方显效；加入剪切种子加速聚集后，G1可逆转种子效应，支持端帽阻断延长。G1/H4对A546D需20倍过量，对H626R自5倍起有效，说明不同突变纤维可被同一肽不同程度抑制。
讨论部分总结方面，研究人员指出该FAS1-4 V624M纤维具溶剂穿透核、Ω形折叠、C2对称蝴蝶截面，核含患者沉积Y571-R588段，但存在四点局限：重组纤维未必等同患者来源；结构来自少数具扭转的纤维；球状附着物未知；SDS处理可能影响形貌与多态。该纤维内部腔面多为带电/极性残基、外表面疏水，与多数淀粉样“内疏外亲”相反，且仅原纤维间有steric zipper，属淀粉样结构异类。LCD突变主要通过破坏天然FAS1-4折叠促 unfolding 与聚集，而非直接参与淀粉样核稳定，因核内几乎不含已知LCD点突变，暗示不同突变或可收敛为相似折叠。端帽肽利用对称原纤维不等长末端实现多界面结合，但高效抑制需高摩尔过量，提示还可能经单体隔离、初级/次级成核调节、离途径物种稳定或碎片改变等机制；G1缩短滞后相，说明其核心同源段可降低成核势垒。该类肽在神经病中受递送限制，在眼病中则无此碍，但尚缺细胞与动物模型验证，未来应以患者相关结构重设计。
结论部分翻译如下：研究人员给出的FAS1-4 V624M纤维cryo-EM结构，在缺乏患者来源结构情况下首次揭示TGFBIp淀粉样聚集的分子细节。该工作为以结构为基础设计抑制剂作为角膜营养不良及其他蛋白质聚集性眼病的可能介入策略提供了概念验证。
