《Current Opinion in Microbiology》：Rewiring lactobacilli: challenges, opportunities, and the translational path to therapeutics
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乳酸杆菌（Lactobacilli）长期以来因其安全性、宿主相容性以及在调节人类健康中的有益作用而被视为有前景的益生菌。然而，野生型益生菌的治疗效果仍受限于靶标特异性有限、对其活性缺乏控制以及临床反应的可变性。合成生物学（Synthetic Biology）的
乳酸杆菌（Lactobacilli）长期以来因其安全性、宿主相容性以及在调节人类健康中的有益作用而被视为有前景的益生菌。然而，野生型益生菌的治疗效果仍受限于靶标特异性有限、对其活性缺乏控制以及临床反应的可变性。合成生物学（Synthetic Biology）的最新进展使得通过精确工程化细菌功能（如治疗分子的生产）来克服这些限制成为可能。尽管取得了这些进展，工程化乳酸杆菌仍面临重大挑战，包括遗传工具包有限、物种和菌株依赖性变异，以及工程菌株稳定性和安全性的不确定性。本综述讨论了乳酸杆菌治疗应用工程化的当前格局，特别关注正在进行临床评估的候选菌株。此外，概述了需要克服的关键技术障碍，并提出了加速其转化为临床有效且可靠的微生物治疗药物的潜在解决方案。
乳杆菌的天然相容性与健康益处（Native compatibility and health benefits of lactobacilli）
人体栖息着大量对健康有深远影响的微生物。其中，共生菌群天然存在于宿主中，常有助于维持健康组织功能，分布于口腔、胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道和皮肤等多个部位。在多样性细菌群体中，芽孢杆菌门（Bacillota）以异质丰度定殖于这些位点。该门中，乳杆菌包含约400个物种，其中少数是人类共生菌，构成最大的益生菌类群。乳杆菌在发酵食品生产中广泛使用，如酸奶、泡菜、康普茶和酸菜。此外，它们通过产生乳酸、短链脂肪酸（SCFAs）、B族维生素（B2、B9、B12）和细菌素，在维持稳定的肠道环境、增强肠道屏障、抑制病原菌定殖中发挥关键作用。例如，乙酸盐主要由乳杆菌产生，而丁酸盐和丙酸盐则通过与其它肠道微生物的交叉喂养相互作用间接刺激产生。细菌素作为核糖体合成的抗菌肽，通过选择性抗菌活性抑制艰难梭菌（Clostridium）和利斯特菌（Listeria）等机会致病菌，有助于定殖抗性和宿主保护。临床研究显示，乳杆菌补充剂可改善肠易激综合征患者的抑郁症状、降低LDL胆固醇、缓解膝骨关节炎疼痛。除口服外，非口服递送方式如滴眼液、阴道制剂和鼻内给药也展示了乳杆菌的局部治疗潜力和组织相容性。多个初创公司已推出或正在开发基于乳杆菌的产品，如Verb Biotics的Lp815（促进γ-氨基丁酸产生）、BASF的Probiolift、L’Oréal旗下Lactobio的抗衰老护肤品、Metagenics的Ultraflora、Osel的LACTIN-V以及YUN Probiotherapy的微胶囊外用制剂等，体现了乳杆菌在健康领域的巨大商业化潜力。
益生菌治疗的局限性（Limitations of probiotics for therapy）
尽管益生菌具有促进人类健康的潜力，但在不同患者群体中有效治疗特定疾病仍具挑战。主要障碍在于益生菌的生物活性通常不可控：同一菌株可因营养可利用性、宿主生理状态和局部代谢应激而表现不同。这种多因素依赖直接影响有益代谢产物的输出。例如，细菌素和其它生物活性代谢物（如SCFAs、B族维生素）的产生会随可利用碳源、pH和生长条件而改变，使患者间分泌组难以预测。这种变异性解释了基于野生型菌株的产品在临床试验中观察到的活性不一致现象。
基因工程带来的机遇（Opportunities enabled by genetic engineering）
为增强乳杆菌治疗疾病的适用性和有效性，研究者正探索对所需功能进行基因工程改造。基因工程提供了克服乳杆菌固有活性变异的策略，将其转化为能够编程化、靶向药物递送和生物传感的工程化活体治疗生物工厂。这需要含有可靠且特征明确的元件（如组成型/诱导型启动子、RNA聚合酶、阻遏物、激活因子等）的遗传工具箱，以组装功能性的基因电路，实现按需治疗分子生产和释放。药物递送可采用分泌、表面展示和自溶等策略。工程化乳杆菌已被用于表达异源蛋白质，包括白细胞介素-10、超氧化物歧化酶、elafin、疫苗抗原等。多个公司正在开发相关候选产品，如BiomEdit的重组罗伊氏乳杆菌（L. reuteri）分泌纳米抗体以治疗鸡坏死性肠炎；Ilya pharma的ILP100（表达CXCL12-α趋化因子，用于伤口愈合）处于2期临床，ILP101（表达CXCL17趋化因子，用于结肠炎）为口服制剂；Osel的MucoCept基于工程化约氏乳杆菌（L. jensenii）表达HIV抑制剂氰病毒素-N。体内研究还展示了工程化植物乳杆菌（L. plantarum）作为肿瘤靶向原位治疗和鼻内脑靶向药物递送平台的潜力。
乳杆菌基因工程的障碍（Barriers to the genetic engineering of lactobacilli）
乳杆菌可用的遗传工具箱在过去三十年中虽缓慢增长，但许多工具为实验室特定菌株定制的解决方案，跨菌株和跨物种的可移植性有限，导致可预测的遗传编程常需菌株特异性筛选和微调。此外，许多乳杆菌转化效率低，存在限制-修饰系统阻碍外源DNA摄取，需要菌株/物种特异性电穿孔方案和载体骨架。尽管这些障碍并非乳杆菌独有，但显著增加了建立可重复工程流程的工作量。基因编辑技术如重组工程和CRISPR/Cas在乳杆菌中的实施和效率也呈物种依赖性。另一个挑战是缺乏被广泛采纳的模型底盘菌株，类似于益生菌工程领域的E. coli Nissle 1917。虽然L. plantarum WCFS1和L. reuteri ATCC PTA 6475等菌株正被用作工程平台，但标准化和跨研究验证程度仍相对有限。此外，需考虑重组功能发挥作用的生理环境，如发酵过程中乳杆菌常酸化细胞外环境，而益生菌应用可能暴露于肠腔近中性条件，因此治疗构建体不仅需遗传表达，还需在相关生理条件下保持功能。最后，生物安全和监管问题包括遗传稳定性、生物遏制、脱靶/不良反应、水平基因转移等，这些也是临床实施和监管审批的重要考虑因素。
未来方向（Future directions）
为构建乳杆菌兼容的遗传工具箱，一种策略是从实验室特定菌株工程转向模型菌株开发。需从针对特定治疗生态位优化的物种中，选择少数充分表征的乳杆菌作为模型菌株。例如，L. plantarum WCFS1可作为皮肤、口腔和肺部应用的底盘；L. crispatus CTV-05和L. jensenii ATCC 25258可用于女性生殖道干预；L. gasseri ATCC 33323和L. acidophilus DSM 20079用于胃肠道治疗；L. reuteri DSM 17938用于动物和肠道应用。模型菌株的选择需考虑基因组注释完整、安全性记录良好、转化方案和基础遗传工具可用、靶部位持久性知识、工程元件稳定性以及无问题毒力或抗性基因。在这些模型菌株中，需通过设计-构建-测试-学习循环（design-build-test-learn cycles）建立优化和标准化的遗传元件与工作流程，并借助高通量自动化筛选提高命中率，系统测试元件跨菌株/物种的可移植性。机器学习模型可基于积累的数据揭示跨物种功能有效的序列特征。
另一种值得探索的策略是开发工程化乳杆菌联合体（consortia）。多个工程菌株可组合起来，在群体中分工执行复杂任务，例如多步生物合成中每个重组菌株专一执行一个反应，或每个菌株分泌一种治疗分子同时保留固有益生特性。这种劳动分工方法在乳杆菌中尚未充分探索，有望比等基因菌株更有效地应对宿主生态位复杂性和遗传工程复杂性。然而，建立稳定细菌联合体面临营养竞争、生长速率差异、交叉喂养和拮抗相互作用等挑战。
此外，封装增强工程功能是另一有前景的途径。通过将微生物物理包封在生物相容性聚合物材料中，可实现药物和营养物质的双向通量。这类工程活体材料（Engineered Living Materials, ELMs）可保护基因修饰微生物免受宿主因素影响，反之亦然，从而提高微生物在胃肠液中的存活率，实现持续和局部药物递送，改善成本效益和整体安全性。材料可基于物理交联聚合物（如海藻酸盐、壳聚糖、明胶、琼脂糖）或化学交联聚合物（如Pluronic F127二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯等），以核壳形式制造为微珠、纤维、网状物、微凝胶等。研究表明，海藻酸盐封装可提高L. plantarum重组蛋白的释放稳定性，并抑制泄漏型诱导系统的背景表达、改善动态范围。封装还能创造空间分离但化学互动的微环境，有助于建立稳定的共培养体系以执行分工功能，减少菌间竞争并可按需比例组合。需要注意的是，封装会以依赖物种和材料机械性能的方式改变细菌的生长和代谢行为，进而影响工程功能。最终，通过聚焦少数充分表征、基因组测序的生态位特异性模型菌株，建立标准化工程工作流程，扩展跨菌株/物种功能比较，并探索封装等新策略，可释放乳杆菌在个性化、位点特异性治疗递送中的潜力。
