综述：纳米机械谐振器作为活细胞的探针

《Current Opinion in Structural Biology》：Nanomechanical resonators as probes for living cells

　　

纳米机械谐振器，包括悬浮微通道谐振器（SMRs）、微悬臂梁、双端固支梁、薄膜以及光机械盘式谐振器，通过传感器谐振频率的变化或机械涨落，实现对单细胞物理性质的无标记测量。这些性质包括细胞质量、密度、刚度、黏弹性、折射率、固有振动模式以及主动涨落。本文综述了纳米机械传感在活细胞研究中的最新进展，重点阐述了该技术如何从质量测量发展为多维度的物理细胞表型分析。我们讨论了新兴能力，如振动光谱学、基于纳米运动的 functional assays，以及与单细胞转录组学的整合。最后，我们讨论了当前面临的挑战以及将纳米机械测量转化为细胞生物学、精准医学、抗癌药物反应预测和抗菌药物敏感性检测等广泛实用工具的未来应用前景。

引言

活细胞的物理性质，包括质量、密度、刚度、黏弹性和纳米尺度振动，携带着关于其增殖状态、代谢活性和病理转化的信息。纳米机械谐振器因其机械响应对质量、力和能量耗散的微小变化高度敏感，特别适合获取这些性质。它们可以在液体环境中工作，具有单细胞分辨率，且无需对细胞进行化学修饰。三种互补的方法在实验和理论进展中受到最多关注：1）质谱法，细胞与谐振器发生机械接触或在谐振器内部运动，产生的频移编码了细胞质量、刚度和密度；2）振动光谱法，谐振器检测细胞自身的机械共振；3）纳米运动检测，细胞通过传递低频纳米尺度运动来改变谐振器的振动噪声，提供代谢活动的实时读数。纳米机械谐振器提供的这些物理可观测量不仅仅是细胞的机械描述符，更是基本生物学过程的定量报告者，能够反映细胞骨架状态、膜运输、渗透调节、代谢活动和细胞内组织，从而将细胞力学与细胞生理学和疾病直接联系起来。

利用纳米机械谐振器进行单细胞质量测量

单细胞纳米机械质谱法

将梁式谐振器与电喷雾电离（ESI）等软电离技术结合，在真空中递送分析物，首次实现了对单个蛋白质的实时称重，通过跟踪单模配置中的突然频率下移来实现。后来，多模操作实现了两个或多个振动模式的同时跟踪，从而可以同时确定颗粒质量和吸附位置。将该方法应用于完整细菌，可在单次测量中同时获得细胞的机械刚度和干质量，干质量定义为样品干燥后细胞成分的质量。超薄氮化硅薄膜支持密集的振动模式谱和大感应面积，将该概念扩展到细菌群体，具有亚飞克质量精度和高通量，能够确定细菌干质量分布并估计分裂时的细胞质量。该技术也已通过耦合气动透镜的谐振器阵列，对超过100 MDa的病毒衣壳进行了演示。值得注意的是，纳米机械质谱法也在大气压下通过集成聚合物片上聚焦透镜得到验证，能够测量单个SARS-CoV-2颗粒。这些研究共同证明了该技术在从蛋白质到病毒、包括完整细菌细胞在内的多种生物分析物中的通用性。

用于液体中单细胞质量测量的悬浮微通道谐振器

悬浮微通道谐振器（SMRs）引入了一种概念上不同的几何结构，细胞在谐振器内部运动。这些谐振器已实现不同的几何构型，最常见的是单端固支的U形器件。在这种配置中，通过将微流控通道封装在真空包装的悬臂梁内，消除了环境黏性阻力；每个穿过通道的细胞都会产生一个瞬态频率凹陷，其大小与其浮力质量成正比，浮力质量定义为细胞质量与排开周围流体质量之差，从而实现亚皮克级质量分辨率和每分钟数百个细胞的高通量测量。通过最多十二个谐振器组成的传感器阵列对同一细胞进行重复称重，可以在生理学有意义的分辨率下解析单个哺乳动物细胞、细菌和酵母菌的质量累积速率（MARs），即单位时间内浮力质量的分数增加。该技术能够识别具有不同生长动力学的亚群。

用于液体中单细胞质量测量的微悬臂梁传感器

微悬臂梁从早期发展以来就被用于测量附着在其表面的贴壁细胞的惯性质量，惯性质量指细胞的总物理质量，不同于干质量和浮力质量，它们对应细胞质量的不同物理定义。凭借毫秒级时间分辨率和皮克级质量灵敏度，该配置已被用于测量与ATP合成和水运输相关的随机质量涨落，显示病毒感染期间细胞生长停滞。使用聚焦离子束减薄改进悬臂梁设计，提高了质量灵敏度并抑制了细胞迁移带来的伪影。由于细胞保持附着在悬臂梁表面，该方法能够在生理条件下进行长期测量并连续监测同一细胞。应用于出芽酵母时，微悬臂梁揭示了质量生长以离散的线性段进行，并伴有突变的速率转换，为细胞生长调控提供了新见解。尽管与SMR或纳米机械质谱法相比通量较低，但以这种方式应用的微悬臂梁保留了制造简单和与光学显微镜等互补技术直接集成的优势。

单细胞多参数测量

早期的纳米机械传感方法主要集中于质量测量，后续发展使得能够同时量化同一细胞的多个物理参数，提供了更全面的机械细胞表型描述，并成为近期研究工作的主要焦点。如上所述，谐振梁频移的多模跟踪允许从单次细胞吸附事件中同时获得质量和机械刚度。在透明微毛细管谐振器中，同时读取流动细胞的谐振频移和光学反射率（折射率），能够以每分钟300个细胞的速率进行细胞表型分析，识别来自同一组织类型的癌细胞和健康细胞系。利用SMRs，细胞可以在两种不同密度的流体中依次称重，从而同时获得绝对细胞密度（分子拥挤的指标）和浮力质量。具有扩大感应体积的SMR阵列探测了覆盖100倍质量范围的多倍体白血病细胞的生长，解耦了细胞周期依赖性和细胞大小依赖性对生长效率的贡献。有丝分裂细胞被证明在体积上可逆地膨胀超过10%，随后通过在H₂O和D₂O中依次称重进行干质量监测，解析出这种膨胀伴随着有丝分裂进入时溶酶体内容物的胞吐。SMR中实现的一种新方法能够以亚分钟时间分辨率无创监测单细胞机械特性，使用尺寸归一化声散射（SNACS）作为刚度相关读数，同时测量浮力质量，揭示有丝分裂期间单细胞刚度的动态变化。

将纳米机械测量与互补分析技术相结合，也为我们对细胞力学与细胞生理学关系的认识带来了重大进展。串联SMR已与下游单细胞RNA测序耦合，使每个细胞的生物物理数据（包括质量和MAR）与其转录组相关联。2025年的一项研究使用浮力质量和SNACS的SMR测量，并与转录组数据相关联，识别了原发性套细胞淋巴瘤标本中致癌性B细胞受体信号传导的生物物理相关性，说明纳米机械表型分析可以补充分子谱分析。SMR与荧光细胞周期标志物的耦合，使得能够直接观察数千个单个哺乳动物细胞的生长速率与细胞周期阶段之间的关系。2025年的一项里程碑式研究将荧光排除显微镜与SMR集成，以0.03%的精度每小时测量30,000个单细胞的密度。应用于原代人淋巴细胞时，该组合平台揭示，随着细胞从静止状态进入细胞周期，密度及其细胞间变异性均系统性降低，将密度定位为增殖细胞状态的敏感生物物理指标。

单细胞固有振动模式

活细胞是否维持固有机械共振这一问题早在1951年就被提出，但由于生理流体环境对细胞振动施加了强黏性阻尼，实验上难以解决。理论分析预测细菌和酵母菌的共振频率在kHz-MHz范围内。最近，在空气中进行的光机械盘式谐振器实验证实，沉积在GaAs盘式谐振器上的单个干燥细菌在环境条件下表现出数百兆赫兹的振动模式，说明固有振动光谱可以提供超越传统质量和刚度测量的信息。然而，在生理条件下获取活细胞的准确测量需要考虑其复杂的机械响应。细胞黏弹性改变动态质量测量的认识可追溯至2010年，当时研究人员在阵列化纳米机械基座谐振器上称重单个贴壁人细胞时观察到“缺失质量”效应。通过采用两自由度集总质量模型，他们证明柔软的活细胞不能与传感器完全同相振动。十年后，该模型与干涉测量技术相结合，实时同步跟踪整体黏弹性特性和质量涨落，表明细胞的整体黏弹性高度动态，并在有丝分裂变圆等事件中发生显著变化。为了更好地理解细胞在更快时间尺度上如何耗散和储存能量，研究人员于2021年开发了一种使用两个微悬臂梁限制并主动压缩单个细胞的平行板测定法。通过扫描1至40 kHz之间的驱动频率，他们成功测量了变圆HeLa细胞的连续高频流变学。利用称为机械去嵌入的理论框架，他们提取了频率相关的储能模量和损耗模量，证明细胞黏弹性遵循细胞骨架依赖的幂律行为。2024年发表的一项独立研究使用光热驱动微悬臂梁称重HeLa细胞，证明如果悬臂梁的振荡频率接近或超过细胞整体本征频率，内部黏性阻尼会阻止整个细胞与传感器同相运动，导致对细胞真实质量的显著低估。通过应用集总质量模型，他们能够提取该整体本征频率以及细胞的平均品质因子。2024年，在生理条件下活人细胞中特定、独特的几何变形模式的检测最终得以实现。研究人员通过寻找负载单个活细胞的微悬臂梁被动高频热涨落谱中的特征异常，证明了这些固有细胞机械共振的存在。关键在于一种称为质量传递函数（MTF）形式的新理论框架，该框架将细胞视为频率依赖的复杂黏弹性附加质量。细胞共振在该光谱中表现为特征特征：同相分量（实部）中的S形转变和异相分量（虚部）中的耗散峰。首次在附着于纤连蛋白包被微悬臂梁并维持在培养基中的单个人乳腺上皮细胞（MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231）中实验测量了固有振动模式。在1 kHz–1 MHz范围内记录的热涨落光谱揭示了两个细胞振动模式的清晰特征：10–30 kHz的宽弯曲模式和150–180 kHz的伸展模式。这些模式的高内部耗散使用幂律黏弹性模型量化，与之前的高频流变学观察一致。在该模型中，损耗由幂律指数β_cell控制，范围从0（完全弹性）到1（纯黏性）。每个模式的相应品质因子可计算为Q_cell = cot(β_cellπ/2)。作者提取了与这些模式相关的共振频率，连同细胞质量（m_cell）、接触半径（R_cont）、弹性模量（E_cell）和幂律指数（β_cell），产生了实时演化的单个贴壁细胞前所未有的机械生物学画像。