长链非编码RNA Peanut（Gm11454）在出生后视网膜发育过程中使祖细胞偏向神经发生和视杆细胞光感受器分化

《Developmental Biology》：The long noncoding RNA Peanut ( Gm11454) biases progenitors towards neurogenesis and rod photoreceptor differentiation during postnatal retinal development.

　　

长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）在视网膜发育过程中呈现空间和时间特异性的表达。新发现的长链非编码RNA Peanut促进视杆细胞光感受器的分化。Peanut调节细胞周期进程和视网膜神经发生。Peanut过表达导致Tox2表达和Notch信号通路的下调。

**论文解读：长链非编码RNA Peanut调控出生后视网膜发育中祖细胞神经发生与视杆细胞分化的机制研究**

**一、研究背景与问题**

脊椎动物视网膜由七种主要细胞类型组成，这些细胞排列成三层核层结构，将视觉刺激转化为电信号并传递至大脑。所有视网膜细胞均来源于单一的视网膜祖细胞（retinal progenitor cells, RPCs），这些祖细胞通过增殖维持祖细胞群体，或经历神经源性分裂和随后的胶质源性分裂以完成终末分化。在发育过程中，七种主要视网膜细胞类别按照保守且部分重叠的时间顺序产生：小鼠中视网膜神经节细胞、水平细胞、视锥细胞和无长突细胞主要在胚胎期分化，而视杆细胞、双极细胞和Müller胶质细胞则在出生后产生。尽管已有大量研究鉴定了调控视网膜神经发生和细胞命运的关键转录因子及表观遗传机制，但基因调控网络（gene regulatory networks, GRNs）的精确时间控制和细胞命运时序决定的机制仍不完全清楚。近年来，长链非编码RNA（lncRNAs）在神经系统发育中的广泛表达和功能受到越来越多的关注。LncRNAs是一类长度超过200个核苷酸且缺乏显著蛋白质编码潜能的转录本，可通过多种机制调控基因表达。与蛋白质编码基因相比，lncRNAs具有更高的组织和细胞类型特异性。在脑发育过程中，差异表达的lncRNAs可作为分子“开关”基因，使祖细胞从增殖性分裂转向神经源性分裂。研究人员假设lncRNAs在视网膜中可能发挥类似作用，调控祖细胞的增殖-神经发生转换并影响细胞命运决定。然而，目前关于lncRNAs在视网膜发育中功能的研究仍然有限，仅有少数lncRNAs如Vax2os、Tug1、RNCR2（Miat）和Six3os1等被证实参与视网膜发育调控。因此，系统筛选和鉴定调控视网膜发育的关键lncRNAs具有重要科学意义。

**二、研究主要技术方法**

研究人员利用已发表的发育时间序列RNA测序数据（Stein-O'Brien et al., 2019; Zibetti et al., 2019）筛选在视网膜祖细胞（RPCs）和有丝分裂后细胞（PMCs）中动态表达的lncRNAs，并使用显色原位杂交（in situ hybridization, ISH）验证其时空表达模式。采用视网膜电穿孔技术（ex vivo和in vivo）进行基因过表达和CRISPRi介导的基因敲低实验。利用CRISPR/Cas9系统生成Peanut基因敲除（Peanut-/-）小鼠模型。通过免疫荧光、EdU掺入实验、流式细胞术分析细胞周期、qRT-PCR、MS2适体标记、亚细胞分级分离、电生理记录（electroretinography, ERG）、H&E染色及批量RNA测序（bulk RNA-seq）等实验方法，系统研究Peanut在视网膜发育中的功能。其中RNA-seq数据和scRNA-seq数据来自已发表的数据库（如Clark et al., 2019；Tran et al., 2019；Yan et al., 2020），电穿孔实验使用CD1小鼠，基因敲除小鼠维持在C57Bl/6J背景。

**三、研究结果**

**3.1 LncRNAs在发育视网膜中差异表达并呈现时空和细胞类型特异性表达模式**

通过分析E14和P2时期RPCs和PMCs的RNA-seq数据，研究人员鉴定出大量动态表达的lncRNAs，其中包括已知的Miat以及多个未被表征的lncRNAs（如Gm29266、Gm16551、Prox1os、Nfia-os、Sox8os等）。原位杂交证实了这些lncRNAs的时空表达模式。进一步分析scRNA-seq数据发现，31.00%的lncRNAs仅在1-2种细胞类型中表达，而蛋白质编码基因仅为7.66%，表明lncRNAs在发育视网膜中具有高度细胞类型特异性。在所有动态表达的lncRNAs中，研究人员关注到未表征的Gm11454，并命名为Peanut。Peanut在早期PMCs和P2 RPCs中富集，定位于小鼠2号染色体Mybl2和Tox2基因之间的基因间区域。ISH显示Peanut在早期视网膜中表达于视黄醛神经节细胞层/内核层，P2时在神经母细胞层和出生后细胞中广泛表达，P14后限制于内核层和神经节细胞层。表观遗传学分析显示Peanut位点在发育过程中保持开放的染色质状态，存在ATOH7、LHX2、NFIA/B等视网膜发育已知调控因子的结合峰，但未检测到CRX结合。

**3.2 Peanut过表达改变视网膜细胞命运决定和RPC增殖**

在P0小鼠视网膜中进行pCAG-Peanut的体内共电穿孔实验，P14时免疫染色分析显示，Peanut过表达使RPCs偏向产生视杆细胞，同时减少双极细胞、无长突细胞和Müller胶质细胞的比例。EdU掺入实验表明，Peanut过表达不改变24小时或48小时内通过S期的细胞数量，但在72小时后显著降低Ki67阳性细胞比例，提示Peanut促使RPCs退出细胞周期。流式细胞术分析显示，Peanut过表达细胞中G1期细胞减少，S期和G2期细胞增多，EdU阳性比例升高，表明Peanut延长S期和G2期，从而促使祖细胞进行终末神经源性分裂。研究人员据此推断，Peanut不直接导致细胞周期退出，而是通过影响细胞周期进程使RPCs偏向神经源性分裂，最终增加光感受器命运。

**3.3 Peanut过表达抑制Notch信号通路和Tox2表达**

通过亚细胞分级分离和MS2适体标记实验，研究人员确定Peanut富集于细胞核并与染色质结合。对Peanut过表达细胞进行qRT-PCR基因面板分析显示，祖细胞/Müller胶质细胞标志物（Ccnd1、Notch1、Sox9）和双极细胞命运标志物（mGlur6、Vsx2）的表达下降，同时多个Notch信号通路转录本水平降低。利用CBFRE（CBF1 Responsive Element）Notch报告基因证实，Peanut过表达显著降低Notch通路活性。此外，Peanut过表达导致其邻近基因Tox2表达下调，而Mybl2表达不受影响。Tox2在发育视网膜中早期广泛表达，P2后逐渐限制于内核层和神经节细胞层。通过CRISPRi抑制Tox2表达后，视网膜中视杆细胞数量增加、双极细胞减少，这一表型与Peanut过表达相似。但Tox2过表达并未激活CBFRE报告基因，提示Tox2不直接调控Notch信号通路。

**3.4 Peanut缺失影响光感受器功能**

利用CRISPR/Cas9技术生成Peanut-/-小鼠，该小鼠在外显子两侧设计gRNAs，产生了约25 kb的基因组缺失。Peanut-/-小鼠可存活且健康，以预期孟德尔比例获得。8周龄Peanut-/-小鼠的暗视ERG显示，在最强暗视光强度下，a波和b波均显著降低，而明视b波未见明显改变，提示视杆细胞功能受损。但H&E染色显示P21、8周和1年时视网膜厚度和形态无明显差异，免疫荧光染色也未发现细胞类型比例的显著性变化。对P0和P22视网膜进行bulk RNA-seq分析，P0时仅检测到极少的转录差异；而P22时，Peanut-/-视网膜有205个基因下调和1362个基因上调。基因本体论分析显示，下调基因富集于视觉感知、光检测、染色质组织及mRNA和DNA代谢过程，其中包含视杆细胞光感受器相关基因如Gnat1和Recoverin。利用已发表的scRNA-seq数据将差异表达基因映射到特定细胞类型，证实下调基因高度富集于视杆细胞。上调基因则富集于突触信号和组织、细胞黏附和迁移通路，包括Müller胶质细胞标志物Slc1a3和无长突/双极细胞标志物Neurod4。值得注意的是，Peanut-/-视网膜中Tox2表达无显著变化，Notch通路核心基因Notch1未受明显影响，CBFRE报告基因活性也无显著差异。

**3.5 Peanut缺失改变RPC细胞周期**

流式细胞术分析显示，P0 Peanut-/-视网膜中G1期和G2期细胞比例显著降低，S期比例不变。pH3染色进一步证实，Peanut-/-视网膜中非顶端pH3阳性（G2期特征）细胞显著减少。同时，Neurog2和Vsx2共标记的神经源性RPCs比例显著降低，而Ki67阳性增殖细胞比例呈增加趋势。这些结果表明，Peanut缺失导致RPC细胞周期缩短，使祖细胞偏向自我更新性增殖分裂，并减少神经源性分裂，但该改变未造成细胞命运比例或视网膜形态的显著变化。研究人员认为，Peanut缺失可能导致发育延迟，进而影响成熟视网膜中光感受器基因表达程序，最终表现为视觉功能减退。

**四、讨论与结论**

本研究表明Peanut在发育视网膜中呈时空特异性表达，并通过调控细胞周期进展来影响RPC的神经发生偏向。Peanut过表达延长S期和G2期，促进RPCs进行神经源性分裂，增加视杆细胞命运，同时抑制Notch信号通路和Tox2表达。相反，Peanut缺失缩短细胞周期相位，增加增殖性分裂并减少神经发生，但未改变细胞命运比例，仅导致光感受器基因表达下降和视觉功能轻度受损。研究还发现Peanut与染色质相关，推测其可能通过调控靶基因表达或染色质结构来发挥作用。然而，Peanut的直接结合靶点和分子机制仍需进一步探索。Tox2作为Peanut的邻近基因，被证实参与视网膜细胞命运调控，但可能并非直接通过Notch通路发挥作用。此外，Tox2的免疫系统功能已知，而其在神经系统中的功能尚未阐明，本研究首次揭示了Tox2在视网膜发育中的作用。综合来看，Peanut通过调节细胞周期进程和光感受器基因调控网络，在视网膜发育中起到精细调控作用，为理解lncRNAs在神经发育中的功能提供了新的视角。该研究成果发表在《Developmental Biology》上，为后续研究Peanut及其同源转录本（如人类LOC101927200）的功能及视网膜疾病相关机制奠定了基础。

**研究结论**

本研究表明，长链非编码RNA Peanut在出生后视网膜发育过程中调节视网膜祖细胞的细胞周期进程和神经发生。Peanut过表达延长G2期，促使祖细胞偏向神经源性分裂，并促进视杆细胞光感受器分化，同时抑制Tox2表达和Notch信号通路。Peanut缺失导致细胞周期缩短、增殖性分裂增加和神经发生减少，并使成熟视网膜中光感受器基因表达下降，引起视杆细胞功能轻度受损。因此，Peanut是调控视网膜祖细胞神经发生偏向和光感受器基因调控网络建立的重要因子。