去氧胆酸盐和甘氨酸去氧胆酸盐的亚胶束聚集物通过膜扰动抑制体外CYP3A氧化

《Drug Metabolism and Disposition》：Submicellar Aggregates of Deoxycholate and Glycodeoxycholate Suppress In Vitro CYP3A Oxidation via Membrane Perturbation

　　**摘要**细胞色素P450 3A4（CYP3A4）和3A7（CYP3A7）特异性催化脱氧胆酸（DCA）和甘氨脱氧胆酸（GDCA）的1β-和5β-羟基化。它们在微粒体和重组CYP3A4/3A7中的氧化速率在低底物浓度下（DCA最高400 μM，GDCA最高250 μM）符合Hill动力学模型，但在亚胶束浓度下逐渐下降，在达到或超过临界胶束浓度（CMC）时达到完全酶失活。我们假设这种非典型动力学行为源于DCA/GDCA的亚胶束聚集物对微粒体囊泡的破坏。透射电子显微镜显示，亚胶束DCA未损害囊泡完整性，而在1000 μM及以上时膜破坏变得明显。光谱分析（紫外、核磁共振和胆红素探针荧光）确定两种胆汁酸的CMC约为1000 μM，并表明在该阈值以下存在寡聚物。值得注意的是，在寡聚物形成的浓度下，DCA/GDCA对胞质硫酸转移酶没有抑制作用；然而，它们通过苯乙基苯胺和美沙多巴氧化分别探测到，显著抑制了膜相关的CYP1A2和CYP2D6活性。这种胞质酶与囊泡结合酶之间的差异性敏感性证实了所提出的囊泡膜依赖性机制。总之，我们的发现强烈表明，亚胶束DCA和GDCA通过涉及囊泡膜依赖性机制的途径，自我抑制其CYP3A催化的氧化，其自组装与观察到的异常动力学密切相关。**引言**初级胆汁酸（BAs），即胆酸（CA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）及其甘氨酸或牛磺酸结合物，在肝脏中由胆固醇合成[1,2,3]。在肠道中，微生物将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，即脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA），这些次级胆汁酸被排泄或再吸收以进行宿主循环[4,5,6]。这些次级胆汁酸比初级胆汁酸具有更大的亲脂性、渗透性和细胞毒性[7,8]。再吸收后，它们经历类固醇骨架氧化还原修饰形成三级胆汁酸[9,10,11,12]，通常通过尿液排泄[13,14,15]。人类细胞色素P450 3A4（CYP3A4）和3A7（CYP3A7）特异性催化DCA和甘氨脱氧胆酸（GDCA）的区域选择性氧化，主要在C-1β和-5β位置[9,12]。这些羟基化代谢物作为内源性CYP3A生物标志物的候选物，用于个体化给药[16,17,18]和药物相互作用评估[19,20,21]。有趣的是，DCA和GDCA的CYP3A介导氧化在体外微粒体和重组系统中的动力学是非典型的[10,11,12]。它们的氧化速率在低底物水平（DCA 1-400 μM，GDCA 30-250 μM）下符合Hill动力学模型，随着底物水平增加而逐渐下降，在达到或超过临界胶束浓度（CMC）时达到完全酶失活。我们之前排除了底物抑制（SI）是亚胶束浓度下1β/5β氧化速率下降的原因[12]；然而，这种异常动力学背后的机制仍然不清楚。关于非典型动力学的一种提出的机制是DCA和GDCA的聚集干扰了它们与CYP3A的结合亲和力[10]。CYP3A的活性腔是灵活的，能够识别具有不同分子量的化合物，范围从卡马西平（236 Da）到环孢菌素A（1201 Da）[22]。同时，胆汁酸的准平面两亲性结构驱动逐步、动态的自组装过程[23,24,25,26]。在CMC以下，胆汁酸组装成二聚体和寡聚物，尽管由于它们的尺寸小和环境敏感性，其结构构型仍有争议[27,28,29]。在CMC以上，初级胶束通过寡聚物的疏水相互作用聚集，而较大的次级胶束则通过初级胶束之间的氢键形成。在这方面，亚胶束DCA的聚集可能改变其与CYP3A的结合并减弱氧化转换，从而导致异常动力学。另一个值得注意的机制涉及DCA的亚胶束组装，这损害了微粒体P450系统的囊泡膜完整性，从而显著贡献于观察到的异常动力学表型。肝微粒体是从内质网（ER）和其他亚细胞器衍生而来的异质性囊泡，具有膜结合的P450系统，包括CYP酶和NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）[30,31]。在这个系统中，CYP从CPR接受电子以驱动氧化催化，而细胞色素b5（Cyt b5）参与特定的反应[32,33]。已知胆汁酸能溶解囊泡膜形成混合胶束，通常在超过其CMC的浓度下[34]。根据囊泡到胶束转变模型，胆汁酸分子逐步插入磷脂双分子层，直到膜饱和触发溶解[34,35]，这一过程将P450转化为其非活性P420形式，导致完全丧失加氧酶活性[36]。值得注意的是，在无甘油介质中，我们在纯化的CYP3A酶中观察到P450到P420的浓度依赖性转化，DCA范围为1.7-1150 μM[10]。然而，这种失活模式与基于溶剂的系统中在约1-300 μM底物浓度下观察到的Hill型动力学不一致，表明亚胶束DCA可能对分离的与膜嵌入的CYP3A产生差异性失活效果。这种差异突出了脂质双分子层环境在维持氧化还原复合物的构象完整性和确保胞质催化结构域之间高效电子传递耦合方面的关键调节作用，这一见解与新兴的观点平行，即膜锚定和蛋白质间取向对于CYP3A4、CPR和Cyt b5之间的最佳功能协同作用是必不可少的[37,38]。在本工作中，我们假设非典型动力学行为源于DCA和GDCA的亚胶束组装物诱导的囊泡膜破坏。为了测试这一假设，我们对两种胆汁酸进行了氧化动力学分析，通过透射电子显微镜（TEM）评估了微粒体囊泡形态，使用紫外、核磁共振和胆红素探针荧光光谱表征了聚集状态，并通过平行的苯乙基苯胺/美沙多巴氧化（膜结合的CYP1A2/2D6）和DCA/GDCA硫酸化（胞质硫酸转移酶，SULT）评估了膜依赖性。我们的结果表明，亚胶束DCA/GDCA在CMC以下不会明显改变囊泡完整性，虽然它们不会自我抑制其胞质硫酸化，但显著抑制了膜相关的CYP1A2/2D6活性。这种胞质酶与囊泡结合酶之间的差异性敏感性为囊泡膜依赖性机制提供了令人信服的证据。总之，我们的发现确立了亚胶束DCA和GDCA通过这种膜依赖的过程自我抑制其自身的CYP3A催化氧化，其自组装与观察到的异常动力学密切相关。**章节摘要****材料与试剂**DCA、GDCA、D?O、3-(三甲硅基)-丙酸-D?钠盐（TSP-D?）、胆红素、脱氧胆酸3-硫酸盐（DCA-S）和甘氨脱氧胆酸3-硫酸盐（GDCA-S）购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密苏里州）。1β-羟基脱氧胆酸（1βh-DCA）购自QCC（纽瓦克，特拉华州）。5β-羟基脱氧胆酸（5βh-DCA）、1βh-GDCA和5βh-GDCA是在我们之前的工作中合成的[12]。苯乙基苯胺和美沙多巴购自TRC（多伦多，安大略省）。内标物（IS）...**亚胶束DCA/GDCA在没有囊泡破坏的情况下使CYP3A失活**与之前的观察一致[10,11,12]，图1A显示DCA和GDCA在HLM中的氧化动力学在低底物浓度（DCA：1-400 μM，GDCA：30-250 μM）下遵循Hill模型。然而，随着底物水平进一步增加，代谢转换逐渐下降，动力学无法通过底物抑制模型来解释。图1B显示DCA和GDCA在重组CYP3A4和CYP3A7系统中呈现相似趋势，仅在...方面有所不同**讨论**在本工作中，我们着手区分关于DCA和GDCA非典型CYP3A氧化动力学的两种机制假设：(i) 底物组装干扰与活性位点的结合，以及(ii) 亚胶束寡聚物破坏维持功能性CYP3A活性的囊泡膜环境。结合我们之前发表的关于纯酶结合动力学的研究结果[10]，本研究支持第二种，即膜依赖性机制，同时提供了...**数据可用性声明**作者声明支持本研究的所有数据均可在论文中找到。**CRediT作者贡献声明****崔通王：** 撰写 - 初稿，可视化，验证，方法学，调查，正式分析，数据整理。**陈奇：** 撰写 - 初稿，可视化，软件，调查，数据整理。**兰克：** 撰写 - 审阅与编辑，可视化，监督，资源，项目管理，方法学，资金获取，概念化。**作者贡献****崔通王：** 方法学，调查，验证，数据整理，正式分析，可视化，撰写 - 初稿。**陈奇：** 调查，验证，正式分析，可视化，撰写 - 初稿。**兰克：** 概念化，方法学，资源，监督，正式分析，可视化，撰写 - 审阅与编辑，资金获取。**脚注**a) 本研究由中国国家自然科学基金支持（82073921, 82373945）。b) ?同等贡献**致谢**感谢成都赛诺根生物科技有限公司的桂兰兰和曾无爽提供的生物分析设施支持。感谢ChatGPT在稿件准备期间的语言编辑协助。所有作者对最终内容承担全部责任。崔通王|陈奇|兰克四川大学华西药学院，中国成都