基于特异重氮偶联原理的香草酸快速现场视觉检测策略

《Dyes and Pigments》：A Rapid On-Site Visual Detection Strategy for Vanillic Acid Based on the Specific Diazo Coupling Principle

　　

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  我们开发了一种新型的双重重氮萘探针（NADBF），用于检测香草酸（VA）。
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  重氮偶联机制提高了检测的特异性和信号强度。
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  该探针具有宽广的线性检测范围（0.75-45 μM），并且在6分钟内即可达到最低检测浓度（LOD）0.698 μM。
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  该探针在玉米粉中的检测回收率为97.3%-105.9%。
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  该方法具有快速、直观、特异性和灵敏度高的特点，适用于现场检测。

引言

香草酸（VA，化学式为C₈H₈O₄）是一种天然存在的羟基苯甲酸衍生物，广泛分布于谷物、水果、绿茶、啤酒和葡萄酒中[1][2][3][4]。它具有令人愉悦的奶油味和香草风味，因此成为食品和化妆品行业的重要原料[5][6]。香草酸是多种中国传统草药（如丹参（Salvia miltiorrhiza）和黄芪（Astragalus membranaceus）中的特征性酚酸成分[7]。香草酸具有多种生物活性，包括镇痛、抗炎、抗菌和抗氧化作用，以及对抗哮喘、肝脏损伤、癌症和糖尿病的保护作用[8][9][10][11][12]。作为一种既具有生物活性又赋予产品香味的成分，香草酸是最终产品质量的关键因素。此外，由于不同来源或加工方法导致的香草酸含量差异，使其成为产品认证和追溯的理想指标[13]。因此，开发一种高效且灵敏的香草酸分析方法对于食品和药品的质量控制和真实性验证至关重要。

酚类化合物（如香草酸）的定量分析主要依赖于仪器技术，如高效液相色谱（HPLC）[14]、气相色谱-质谱联用（GC-MS）[15]、高效薄层色谱（HPTLC）[16]和毛细管电泳（CE）[17]。然而，这些方法受限于高昂的设备成本、复杂的操作流程和较长的分析时间，难以满足快速现场筛查的需求。电化学传感[18][19]、荧光传感[20][21]和微流控芯片[22]也被用于酚类化合物的分析。尽管这些方法在效率上有显著优势，但仍依赖于专用设备，限制了操作的简便性和结果的直观解释。比色法因其操作简单和视觉响应明显而具有快速检测的巨大潜力[23]。可以通过设计特定的比色探针分子结构来进一步提高分析速度、灵敏度和选择性[24][25]。以往报道的大多数酚类化合物检测探针基于氧化还原反应的纳米颗粒和纳米酶[26][27][28]，或基于Folin-Ciocalteu试剂的显色反应[29][30]。然而，Folin-Ciocalteu试剂不仅与酚类化合物反应，还会与抗坏血酸、还原糖和氨基酸等非酚类还原物质反应，从而导致总酚含量的显著高估[31][32][33]。同样，基于氧化还原反应的纳米酶探针易受复杂基质中其他还原物质的干扰[34]。因此，这些探针对酚类化合物的特异性较差，且孵育时间通常较长。因此，开发一种具有独特识别机制的新型比色探针对于推动比色法在酚类化合物（如香草酸）快速现场检测中的应用至关重要。

重氮化合物能与酚类化合物发生特异性共价偶联，形成稳定的偶氮发色团。与基于氧化还原或配位作用的探针不同，这种共价识别机制能有效排除非酚类还原物质的干扰，因为重氮偶联反应仅发生在具有适当取代基的芳香环上。传统的单重氮探针由于只有一个反应性的重氮基团，信号响应强度有限，从而限制了比色检测的灵敏度。为了解决这一问题，我们设计合成了新型的双重重氮探针1,5-双(重氮四氟硼酸)萘（NADBF）。NADBF以萘的大π共轭体系作为发色骨架，并引入了两个重氮基团以提高响应灵敏度。在本研究中，采用了超声辅助的深共晶溶剂（DES）提取方法[35][36][38]进行样品预处理。选择香草酸作为代表性目标分析物，并系统地开发了一种基于NADBF的可视化比色方法。如图1所示，该方法在6分钟内即可实现稳定的颜色变化，无需更换溶剂或额外的样品处理步骤。这项工作提供了一种新的分子工具，建立了一种适用于现场筛查的工作流程，并为设计针对酚类化合物的比色探针提供了宝贵经验。

章节摘录

材料和仪器

所有化学品均购自上海麦克林生化科技有限公司和北京化学试剂公司。所有溶液均使用杭州娃哈哈集团有限公司提供的纯化水制备。所用溶剂和试剂均按原样使用。玉米粉从当地超市购买。NADBF的合成过程见图S1。

高效液相色谱（HPLC）分析采用岛津SPD-20A系统进行。核磁共振（NMR）谱数据由JEOL JNM-ECZ400S仪器采集。

超声辅助提取香草酸

首先，使用ChCl作为氢键受体（HBA）和尿素作为氢键供体（HBD）合成DES。然后在超声辅助下，利用合成的DES从玉米粉中提取香草酸。HPLC分析证实了香草酸的成功提取，结果见图S4。相关研究[39][40]表明，由于酚类化合物与DES组分之间形成氢键相互作用，酚类化合物在DES中的溶解度

结论

本研究开发了一种新型的双重重氮探针NADBF，用于香草酸的快速比色检测。在超声辅助提取得到的DES提取液中，NADBF通过重氮偶联与香草酸反应，产生明显的颜色变化。该方法在0.75–45 μM的线性范围内能够定量检测香草酸，最低检测浓度为0.698 μM。该方法表现出良好的稳定性和选择性，显示出广泛的实际应用潜力。

作者贡献声明

周帅：撰写初始稿件、方法学设计、实验研究、数据分析。沈瑶：撰写初始稿件、实验研究。王秋月：方法学设计、实验研究。云俊文：方法学设计。王子源：数据分析。田景升：实验研究、数据分析。刘美仪：实验研究。刘杰：撰写、审稿与编辑、资金获取。姚志义：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思

声明与公开

作者声明不存在可能影响本文研究的已知利益冲突或个人关系。

利益冲突声明

? 作者声明不存在可能影响本文研究的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了北京科技大学食品风味交叉创新开放项目和北京Nova计划（20230484307）的财政支持。

周帅|沈瑶|王秋月|田景升|刘美仪|云俊文|王子源|刘杰|姚志义