聚(2-噁唑啉)的功能性亲核试剂封端

《European Polymer Journal》：Poly(2-oxazoline) termination with functional nucleophiles

　　

# 摘要

聚(2-噁唑啉)（POx）代表了聚乙二醇在生物医学应用中的有前景的替代品。为了使POx能够顺利进入临床流程，其组成必须得到充分表征。虽然引发和增长已被深入研究，但终止反应因很少影响聚合物分子量及分散度而被忽视。本文利用一种独特的高灵敏度尺寸排阻色谱（SEC）检测方法，探索了五种功能性亲核试剂的终止效率和机理。这些亲核试剂的选择是因为它们能够通过高效的"点击型"反应进一步修饰。我们量化了聚(2-苯基-2-噁唑啉)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)和聚(2-壬基-2-噁唑啉)的终止反应，并建立了基于亲核性参数（N）的趋势。与水的竞争实验揭示了进一步的差异。硫代醋酸盐是表现最佳的终止剂，即使在有水存在的情况下也显示出接近定量的转化率。总体而言，这项工作展示了POx终止反应的复杂性，并表明在制备用于生物医学应用的POx时不应忽视聚合过程中的这一步骤。

## 引言

聚(2-噁唑啉)（POx）是一类新兴聚合物，在组织工程、抗菌药物和药物递送领域展现出巨大潜力。[1],[2],[3],[4],[5] 与当前的金标准——聚乙二醇相比，亲水性的聚(2-甲基-2-噁唑啉)和聚(2-乙基-2-噁唑啉)被报道具有更低的免疫原性，为未来的生物医学应用提供了重要潜力。[1],[6],[7] POx聚合反应的活性聚合特性使得能够轻松控制化学组成，最终可以控制流体力学半径、自组装、黏度、热响应性、电荷以及聚合后修饰位点的程度。[1],[2],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14] 所有这些优势使得POx成为临床转化的激动人心的材料。然而，用于人体时，必须精确理解聚合反应的所有方面。

POx骨架通过阳离子开环聚合制备。噁唑啉单体通过亲电试剂引发。然后，在最简单的机理中，增长发生在额外的噁唑啉单体对活性噁唑啉鎓的C5位进行亲核进攻时（图1A，i）。然而，在某些单体-引发剂组合中，可通过引发剂离去基团与C5位反应形成共价中心，尽管这不有助于聚合过程的进行。[15],[16],[17] 最后，加入外源亲核试剂导致终止（图1A，ii）。POx的体性质通常通过噁唑啉单体的侧链控制。[18] 为便于（生物）偶联，官能团最常添加到引发端或终止端（分别为α端或ω端），但如果需要多个功能手柄，也可以在单体本身中引入（图1A）。[18] 常用集成到POx中的功能手柄包括烯烃、炔烃、胺、叠氮、巯基和羧酸盐。通过这些策略，POx已与蛋白质（如绿色荧光蛋白和白介素-4）、糖类偶联，并直接用抗生素修饰。[19],[20],[21],[22],[23]

在引入功能手柄的方法中，终止通常是最简单、适应性最强的策略，因为它不影响引发或增长速率。然而，这种简单性导致终止反应研究不足，尤其是与新的引发剂或单体相比，后者需要针对每项新报告进行彻底的动力学研究。[24],[25],[26] 确实很容易忽视ω端功能化的细微差别，因为终止效率很少直接影响分散度（D），且在尺寸排阻色谱（SEC）中不一致性通常不可见。此外，终止的特征峰在1H核磁共振（NMR）光谱中仅占质子的很小百分比。虽然基质辅助激光解吸/电离-飞行时间-质谱（MALDI-TOF-MS）可用于阐明端基身份，但比较聚合物种类之间的相对强度可能会产生误导，因为某些官能团比其他官能团更容易电离。ω端表征的困难仍然是探查反应活性和优化终止效率的障碍。

尽管如此，已有广泛的终止剂被应用于POx，这些在2018年由Hoogenboom及其同事总结，并在2019年由Delaittre进一步阐述。[17],[18] 虽然使用了众多亲核试剂，但其安装条件高度可变——部分原因是探索了不同的链长和单体组合。文献中氮化钠和邻苯二甲酰亚胺钾的常见制备条件为70-80°C加热，"过夜"或24小时（h）。[27],[28],[29] Boc-哌嗪通常仅封端3-4小时，然后与K2CO3"过夜"处理或24小时。[30],[31] 硫代醋酸钾终止制备表明在室温下需要4-12小时。[32],[33] 丙烯酸封端通常需要三乙胺在60°C"过夜"处理。[34],[35] 所有这些例子都报告了通过1H NMR和/或MALDI-TOF-MS实现的定量终止。虽然此列表并未涵盖文献中报道的所有终止条件，但它展示了所使用的条件范围之广。

尽管如此，终止是一种将单个功能手柄添加到POx的极佳方式，使其能够通过各种高效化学进行进一步功能化，如铜催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAc）、应变促进的叠氮-炔烃环加成、巯基-烯反应、酰胺键形成、氨基-炔烃化学、Michael加成和腙形成等。[17],[27],[28],[29],[36] 为增强最终聚合后修饰产物的产率和纯度，建立终止的最优反应条件是必不可少的，因为必须在转化率、官能团稳定性和交叉反应性之间取得平衡。在这里，我们选择关注五种可用于点击反应或偶联化学的常见功能亲核试剂：氮化钠、叔丁基肼甲酸酯（Boc-肼）、邻苯二甲酰亚胺钾、硫代醋酸钾和丙炔酸钠。其中一些亲核试剂已在POx终止中得到充分验证（如氮化钠和硫代醋酸钾），而另一些则仅被初步探索（如丙炔酸钠、Boc-肼）。我们检查了每种亲核试剂的终止效率，最初在室温下，在1、4和18小时后，以确定所需的最小条件集。我们发现终止效率存在相当大的变异性，并根据亲核性、溶解度、吸湿性和进一步反应活性提出了指导原则。

这项工作补充了几项关于噁唑啉终止反应的现有深入调查。1948年，Goldberg和Kelly提出，氧鎓-铵盐活性链端（1）的共振影响氨基酯（2）或酰胺醇（3）产物的形成，分别对应于对C2或C5的亲核进攻（图1B）。[37] 虽然这种分布无法得到良好控制，但他们发现在较高pH下酰胺产物可略占优势。Jerca等人最近观察到2-异丙基-2-噁唑啉在pH 4至9的缓冲液中的水解产物，证实了这一观察结果。[38] 当时几位作者注意到水（H2O）独特地、选择性地开环C2位产生氨基酯产物，如今这已被普遍接受；氨基酯2在碱性条件下和/或高温下重排为酰胺醇3也是如此。[35],[37],[39] 然而，Jerca等人的同一研究表明即使在pH 4下也形成了酰胺醇3，并提出C5产物受热力学控制——而非需要碱性条件。[38] Hünig和Pittman的一些基础研究也支持了这些能量假设，并进一步阐述了每条路径对亲核试剂、阳离子稳定性、时间和温度的依赖性。[40],[41] 对亚胺醚、噻唑鎓和噁唑啉鎓等双位阳离子的若干小分子研究同样证实了C2/C5控制。[42],[43],[44] Fazio在1984年比较了2-乙基-与2-叔丁基-2-噁唑啉的反应活性，表明C2位受阻迫使正丁胺在C5位反应，酰胺产物的收率从乙基取代时的10%增加到叔丁基取代时的100%。[43] 类似地，在环状亚胺醚底物上使用更大的双取代亲核试剂导致专一性产生C5产物。[44] 为研究功能性C5终止的速率，Nuyken等人对哌啶、吗啉、吡啶和4-二甲氨基吡啶与PhOx和2-壬基-2-噁唑啉（NonOx）的噁唑啉鎓三氟甲磺酸盐进行了系统分析。[45] 该工作得出结论，终止速率取决于亲核试剂上的电子密度，大致由pKa指示。作为pKa影响的进一步证据，通过1H NMR表明，使用1当量（equiv.）某些H-X型亲核试剂时终止停滞，并提出需要最终去质子化步骤以产生中性酰胺产物。确实，这一步骤解释了为什么不同课题组在终止的最后一步中使用K2CO3或使用盐类以完全绕过这一步骤。[45]

Nuyken关于终止的工作还为噁唑啉单体在终止效率中的作用提供了某些见解。与2-苯基衍生物相比，观察到2-壬基噁唑啉鎓三氟甲磺酸盐的反应活性降低。这一观察结果通过开环后苯基保留了有利的扩展共轭（而2-壬基取代基则为孤立酰胺）得到了合理解释。受这些发现的启发，我们通过SEC和MS探查了PhOx、NonOx以及2-甲基-2-噁唑啉（MeOx）的终止趋势差异（图1C）。尽管功能性终止剂在日益分散的反应条件下使用日益增加，但对POx终止机理的进一步调查并不多。近期报告也对已建立的-OH和-NH2终止的有效性提出了质疑，导致潜在的结构不一致性，如Delaittre的综述中所强调的。[17],[27],[46],[47] 这项工作利用现代检测方法和新的亲核试剂范围重新审视了我们当前的知识。

## 材料

2-苯基-2-噁唑啉（PhOx）和2-甲基-2-噁唑啉（MeOx）购自Fisher Scientific，分别在氧化钡或氢化钙上搅拌过夜后蒸馏使用。2-壬基-2-噁唑啉通过Witte-Seeliger方法按照既定程序合成，在氧化钡上搅拌后蒸馏使用。[48] 三氟甲磺酸甲酯（MeOTf）购自Acros Organics，使用前蒸馏至Straus瓶中。硫代醋酸钾和

## 结果与讨论

除了POx功能性亲核试剂终止研究稀少外，这项工作主要受到我们课题组近期制备聚合度（DP）为10-15的聚合物的努力的推动，这些聚合物通常在三氟乙醇（TFE）SEC上出现双峰分布。SEC系统的具体细节包括使用20 mM NaTFA作为添加剂的TFE，以最小化与两根PFG柱的相互作用。方法以0.5 mL/min运行56分钟，在210 nm处检测。当前校准范围

## 结论

随着POx在生物医学应用中日益普及，精确的结构理解对于过渡到临床应用是必需的。虽然终止是一种非常有用的方便的POx功能化方法，但深入的研究很少。这项工作旨在重新评估目前用于终止的高度可变条件，并为优化提出一组合理化指导原则。注意到我们的TFE SEC对带电聚合物非常敏感，将保留时间偏移

## CRediT作者贡献声明

Linglan Zhu：撰写——审阅与编辑、撰写——原稿、可视化、验证、调查研究、正式分析、数据整理、概念化。Sangeeta L. Kelkar：数据整理。Prairie E. Hammer：正式分析、数据整理。Ellen M. Sletten：撰写——审阅与编辑、可视化、资金获取、正式分析。

## 利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能会影响本文中报告的工作。

## 致谢

资金由国家卫生研究院普通医学科学研究所提供（R01GM135380，R35GM156610）给予E.M.S。NMR数据由国家科学基金会（MRICHE-1048804）和国家卫生研究院研究基础设施办公室（S10OD028644）资助的仪器获取。作者感谢Quintashia D. Wilson提供实验咨询和一般建议。

Linglan Zhu | Sangeeta L. Kelkar | Prairie E. Hammer | Ellen M. Sletten

加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系，美国加利福尼亚州洛杉矶市，90095