可生物降解三嵌段共聚物用于抗有丝分裂药物与siRNA在癌症治疗中的共递送：合成路线与嵌段序列效应的比较研究

《European Polymer Journal》：Biodegradable triblock copolymers for codelivery of cytostatic drug and siRNA in cancer therapy: A comparative study of synthetic routes and block sequence effect

　　

## 摘要

联合化疗和基于基因的治疗为克服肿瘤耐药性提供了一种策略。在本研究中，我们提出了两种新颖的合成策略，以获得由聚乙二醇甲基醚、聚(ε-己内酯)和聚(L-赖氨酸)组成的可生物降解阳离子两亲性三嵌段共聚物，具有不同的链长和嵌段顺序。与先前报道的点击化学路线相比，所开发的方法提供了更高的产率和纯的三嵌段共聚物分数。共聚物通过尺寸排阻色谱、1H NMR光谱和热重分析进行表征，以确认结构、分子量和纯度。通过纳米沉淀法制备的纳米粒子经动态光散射和电泳光散射及透射电子显微镜评估其流体力学直径、Zeta电位和形态。具有中心PCL位置的三嵌段共聚物形成65 nm的粒子，Zeta电位为20 mV，而具有末端PCL位置的三嵌段共聚物形成140 nm的粒子，Zeta电位为60 mV。一种氮丙啶-三嗪衍生物药物的载药效率达到82–93%，siRNA结合的N/P比最优值为8–13。测定了纳米制剂的稳定性、细胞毒性药物释放动力学以及肝素对siRNA的置换情况。共聚物的细胞毒性低于PLL均聚物，细胞毒性药物纳米制剂对A549细胞的抑制活性比游离药物高1.5–2.5倍。体外通过siRNA负载纳米颗粒对EGFP进行基因沉默达到约50%。在患有Lewis肺癌的C57Bl/6小鼠中，联合纳米制剂使平均生存时间增加了52%（中位生存期65天），实现了最有效的肿瘤生长抑制，优于游离药物和单药纳米制剂，同时部分降低了载体毒性。

## 引言

现代肿瘤化疗面临两个基本问题：抗癌药物的系统毒性以及癌细胞中多药耐药性（MDR）的产生[1]、[2]。为克服MDR，越来越多的研究兴趣集中在联合治疗上。具体而言，抗癌药物的联合递送因其相较于单药系统显著增强的抗肿瘤疗效而引起了广泛关注。各种纳米粒子已确立为有效的靶向递送细胞毒性制剂的平台，通过降低系统毒性、延长血液循环时间，以及通过增强的渗透和滞留（EPR）效应实现肿瘤被动蓄积，从而提高化疗的治疗指数[3]。迄今为止，大量研究报道了双药递送系统的发展，包括基于石墨烯纳米粒子和氧化石墨烯共递送阿霉素和紫杉醇的系统[4]、基于聚(2-噁唑啉)的胶束系统共递送紫杉醇和顺铂[5]、自组装多肽递送系统共递送紫杉醇和伊立替康[6]、基于聚(乳酸-共-乙醇酸)（PLGA）的系统共递送阿法替尼和紫杉醇[7]。

除了联合传统化疗药物外，正在进行的研究还在探索将化疗药物与蛋白质或基因治疗相结合的复杂疗法[8]、[9]、[10]。靶向多条通路可以增强肿瘤抑制，降低毒性剂量和副作用，并改善生存率。如今，多种单克隆抗体已获FDA批准或处于临床试验中用于各种癌症[11]、[12]。抗体与化疗药物联合可产生显著的协同效应[13]。例如，曲妥珠单抗抑制HER2过表达肿瘤，其与紫杉醇、阿霉素、顺铂或环磷酰胺的联合提高了抗肿瘤疗效[14]。一个主要挑战是免疫治疗的耐药性，目前尚未确定能够明确预测哪些患者对抗体治疗反应良好而哪些患者耐药的临床或生物学因素。

目前，基因治疗也获得了极大关注，特别是小干扰RNA（siRNA）和微RNA（miRNA），它们在不与DNA相互作用的情况下抑制翻译后基因表达，从而避免了突变和致畸风险[15]、[16]、[17]、[18]。siRNA/miRNA抑制负责肿瘤细胞生存的蛋白质表达（例如与化疗耐药相关的转录因子NF-κB，或负责血管生成和肿瘤生长的血管内皮生长因子VEGF），而细胞毒性药物则诱导增殖细胞凋亡。基因治疗的一个关键优势是其高效率，仅需少量即可发挥作用。然而，由于血清核酸酶作用导致的不稳定性以及负电荷限制细胞摄取，需要递送系统。大量研究表明，通过单一系统共递送抗癌药物和siRNA比序贯使用不同制剂更有效[19]、[20]。然而，将化学性质不同的制剂（如不带电或疏水性的细胞毒性药物与带负电的siRNA）相结合，提出了重大挑战。

为有效递送基因治疗制剂，递送系统必须首先保护siRNA免受血液中血清核酸酶的降解，这通常通过与阳离子聚合物的紧密静电络合形成多聚体来实现。科学文献中广泛讨论的主要挑战是内体困阻。内化后，多聚体进入内体，如果没有有效释放，将不可避免地遭受溶酶体降解[21]、[22]、[23]。为克服这一障碍，通常建议使用在pH 5–7范围内具有高缓冲能力的聚阳离子[24]。典型的pH敏感递送系统是聚乙烯亚胺（PEI），其通过所谓的"质子海绵"机制发挥作用。根据该机制，未质子化的氨基捕获由V-ATPase泵入的质子，触发氯离子的反向流入和渗透膨胀，最终导致内体破裂。然而，据多位作者报告，完全的内体破裂是低概率事件[25]、[26]。当代观点更倾向于认为，阳离子聚合物通过与阴离子脂质相互作用破坏膜稳定性并诱导瞬时纳米级孔的形成，这一过程被Rehman等人描述为多聚体介导的膜破坏[27]。或者，溶液中存在的游离聚合物链（在高N/P比下的聚合物过量）可能嵌入脂双层，形成"地毯状"结构，进一步促进内体释放[28]。此外，疏水基团（如烷基链、胆固醇、含氟烃或脂肪族聚酯）通过插入内体膜的疏水核心增强内体逃逸，破坏磷脂堆积并产生局部缺陷，从而促进核酸向胞质的释放[29]、[30]。

目前，已报道了多种阳离子聚合物作为能够与核酸形成多聚体并成功递送至细胞内的系统。这些包括不可降解的聚阳离子，如PEI[31]、聚(2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)[32]、聚酰胺胺（PAMAM）树枝状大分子[33]、聚(N-烷基-4-乙烯基吡啶)[34]、聚(乙二醇)-b-聚((2-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)-b-聚(n-丁基甲基丙烯酸酯)[35]等[36]，以及可生物降解的壳聚糖及其衍生物[37]、各种阳离子和阳离子两亲性多肽[38]、[39]、[40]、[41]以及它们与屏蔽多糖[42]和糖聚合物[43]的偶联物。

尽管阳离子聚合物和树枝状大分子在核酸递送方面具有很高的效率，但它们不适合有效封装许多抗癌药物。成功负载疏水性或两亲性细胞毒性药物需要具有疏水区域的递送系统，例如胶束和聚合物胶束、纳米球、脂质体或聚合物囊泡。迄今为止，已提出了广泛的各种系统用于疏水性和两亲性细胞毒性药物的递送。基于合成可生物降解脂肪族聚酯的系统，如聚(乳酸)（PLA）、聚(乳酸-共-乙醇酸)（PLGA）、聚(ε-己内酯)（PCL）及其PEG化衍生物，表现出可预测的水解降解并获得了监管机构的批准[44]、[45]、[46]、[47]、[48]。其他可生物降解系统包括两亲性多肽[49]、[50]和修饰的多糖[51]。除了可生物降解聚合物外，不可生物降解聚合物也被考虑用于纳米制剂的开发。其中，聚(甲基)丙烯酸酯和聚(甲基)丙烯酰胺聚合物占主导地位。例如，聚[N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺]-b-聚(丙ylene氧化物)基胶束最近被报道作为阿霉素的递送系统[52]。此外，Wang等人报道了聚(N-2-羟基丙基甲基丙烯酰胺)-b-聚(N-2-苯甲酰氧丙基甲基丙烯酰胺)基胶束的制备，用于紫杉醇的递送[53]。基于聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸)的纳米粒子已被报道用于阿霉素的有效负载和持续释放[54]。

另一方面，疏水性（紫杉醇、多西他赛）或两亲性（阿霉素、伊立替康）细胞毒性药物与基因治疗制剂的成功共递送，是通过在递送系统中结合阳离子和疏水基团来实现的。例如，Wang等人报道了阳离子脂质体在体外和体内共递送顺铂和miRNA-1284的应用[55]。Zhu等人提出了一种基于聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)（PDMAEMA）三嵌段共聚物与PCL结合的siRNA和紫杉醇递送系统（PDMAEMA-b-PCL-b-PDMAEMA）[56]。负载紫杉醇的聚合物胶束在PC3细胞中表现出比游离紫杉醇更高的药物疗效，这很可能归因于细胞摄取的改善。此外，抗VEGF siRNA和紫杉醇的联合递送实现了VEGF表达的高效敲低。Yunhao等人开发了聚乙烯亚胺-b-聚(D,L-丙交酯)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-b-N-[甲氧基(聚乙二醇)]胶束，用于结直肠癌治疗中miRNA-34a和伊立替康的共递送[57]。体内实验结果表明，所开发的系统具有很强的肿瘤部位蓄积能力，并表现出优异的抗肿瘤疗效。最近，Norouzi等人报道了在PCL-b-PEI-b-PEG胶束中共递送脂溶性吉西他滨前药和抗NF-κB siRNA。使用该系统在胰腺癌和乳腺癌细胞系中显示出了协同增强的细胞毒性和凋亡诱导作用，以及显著的肿瘤细胞迁移抑制[58]。

除了PCL-b-PEI-b-PEG（一种结合了疏水、阳离子和中性亲水嵌段的阳离子两亲性三嵌段共聚物）外，由聚乙二醇甲基醚（mPEG）、PCL和聚-L-赖氨酸（PLL）组成的三嵌段共聚物的合成及其在体外siRNA递送中的应用也是已知的[59]。在引用的研究中，mPEG-b-PCL-b-PLL是通过以下组合合成的：以mPEG为引发剂进行己内酯的开环聚合制备mPEG-b-PCL，然后与含炔的PLL进行点击反应。然而，这种共聚物此前尚未被评估用于细胞毒性药物和基因治疗的联合递送系统。

在本研究中，我们开发了合成一系列由mPEG、PCL和PLL组成的三嵌段共聚物的新策略，并使用这些共聚物制备了siRNA和2,2-二甲基-5-(4,6-氮丙啶基-2-s-三嗪氨基)-m-二氧杂环己烷-5-甲醇（二氧杂啶，DOD）抗癌物质的共递送系统。疏水的PCL嵌段负责DOD的负载，PLL嵌段负责siRNA的结合，而mPEG嵌段提供隐身效果并延长纳米制剂的血循环时间。具体而言，为了获得由mPEG、PCL和PLL组成的三嵌段共聚物，实现了并比较了四种合成策略，包括一条文献路线、一条修改的文献路线和两条新途径（图1）。合成了具有不同嵌段序列和分子量特性的三嵌段共聚物，并应用于研究其负载和释放DOD及siRNA的能力。体外和体内的生物学评估使研究能够考察所开发系统在癌症治疗中的实际潜力。

## 材料

聚乙二醇甲基醚（mPEG，Mn = 5000）、辛酸亚锡（Sn(Oct)?）、甲烷磺酰氯（MsCl）、ε-羧苄基-L-赖氨酸（Lys(Z)）（≥99%）、α-蒎烯（99.0%）、三光气（C?Cl?O?）、二叔丁基碳酸酯（Boc?O）、4-(二甲基氨基)吡啶（DMAP）、苄基氯甲酸酯（ZCl）、33% HBr/CH?COOH均购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）。ε-己内酯（ε-CL）购自J&K Scientific（中国上海）。二氧杂啶（DOD）

## 三嵌段共聚物的合成策略

在本研究中，提出了两种使用大引发剂的新颖聚合策略来合成mPEG-b-PCL-b-PLL三嵌段共聚物，并与先前报道的合成途径进行了比较。已知策略涉及通过叠氮-炔1,3-偶极环加成将mPEG-b-PCL与PLL偶联[59]。为此，首先将mPEG-b-PCL-OH的末端羟基转化为叠氮化物，然后与含炔的PLL进行后续点击反应。

## 结论

在本研究中，成功开发了两条新颖的合成策略（途径C和D），以生产基于聚乙二醇甲基醚、聚(ε-己内酯)和聚(L-赖氨酸)的可生物降解阳离子两亲性三嵌段共聚物。与传统的点击化学路线（产率为9–22%）相比，所提出的方法提供了更高的总产率（高达41%）和不含均聚物杂质的纯聚合物分数，同时能够精确控制聚合度。

## CRediT作者贡献声明

Irina Bagaeva：撰写——初稿，可视化，调查，形式分析，数据管理。
Sergei Silonov：方法学，调查，形式分析。
Ekaterina Sinitsyna：方法学，调查，形式分析。
Yuliia Zmitrichenko：撰写——初稿，可视化，调查，形式分析。
Alexey Nikiforov：方法学，调查。
Viktor Korzhikov-Vlakh：撰写——审阅与编辑，资源，方法学，概念构思。
Gregorii Tochilnikov：撰写——

## 资助

本研究未获得外部资助。

## 利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本论文所述工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

## 致谢

感谢圣彼得堡国立大学研究园提供的NMR光谱（磁共振研究中心）、FTIR光谱（化学分析与材料研究中心）、TEM分析（分子与细胞技术中心）和热重分析（热重与量热研究中心）支持。

Irina Bagaeva | Sergei Silonov | Ekaterina Sinitsyna | Yuliia Zmitrichenko | Alexey Nikiforov | Viktor Korzhikov-Vlakh | Gregorii Tochilnikov | Evgenia Korzhikova-Vlakh

圣彼得堡国立大学化学研究所，Universitetskiy Pr. 26，198504，俄罗斯圣彼得堡