《Fish & Shellfish Immunology》：ALF-like Mediates
Penaeus vannamei Innate Immunity by Recognizing
Vibrio parahaemolyticus
编辑推荐：
•ALF-like 基因在 Penaeus vannamei 中对 V. parahaemolyticus 感染具有反应性。•rALF-like 蛋白质可以结合细菌的 LPS 和 PGN，并发挥抗菌作用。•ALF-like 基因的敲低会降低虾的存活率并增加 ROS/H2O2 的水
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ALF-like 基因在 Penaeus vannamei 中对 V. parahaemolyticus 感染具有反应性。
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rALF-like 蛋白质可以结合细菌的 LPS 和 PGN，并发挥抗菌作用。
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ALF-like 基因的敲低会降低虾的存活率并增加 ROS/H2O2 的水平。
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rALF-like 蛋白质的注射可以提高宿主的存活率并抑制细菌的繁殖。
引言
太平洋白虾 Penaeus vannamei 是一种高质量的蛋白质来源，在全球水产养殖中占有重要地位，其年产量持续增长。目前，中国的产量占全球总产量的 70% 以上 [1], [2]。然而，该行业面临着由病原体引起的大规模死亡事件的重大威胁，尤其是细菌性疾病。在这些病原体中，急性肝胰腺坏死病 (AHPND) 是最致命的细菌性疾病 [3], [4]。2010 年至 2015 年期间，AHPND 传播到了亚洲和南美洲的多个国家，导致了巨大的生产损失 [5], [6], [7], [8]。该病于 2009 年首次在中国被报道，也被称为早期死亡综合征 (EMS) [9]。这种疾病严重影响了虾的产量，给水产养殖行业带来了巨大的经济损失。这些病原体的广泛传播仍然是一个持续的挑战，主要是由于缺乏有效的控制策略。因此，阐明 AHPND 下的宿主-病原体相互作用对于开发有效的预防和控制措施以及促进可持续的水产养殖实践至关重要。
Vibrio parahaemolyticus（V. para）被认为是导致虾 AHPND 的主要病原体，这种疾病最近在全球范围内爆发。作为最早被发现的 Vibrio 病原体之一，它仍然是最具破坏性的病原体之一。在水产养殖环境中，虾很容易受到感染，尤其是在受到物理损伤或通过进食活动时。在这些条件下，细菌可以通过鳃或口腔进入体内，穿透上皮屏障并引发感染 [10]。AHPND 由一种携带编码 PirAB 类毒素 (Vp_PirAB) 的质粒的 V. para 菌株引起 [9], [11]。肝胰腺是主要受影响的器官，感染后会出现特征性的组织病理学病变，如血细胞浸润和管状上皮细胞的广泛脱落 [12]。值得注意的是，实验表明，将 P. vannamei 浸入引起 AHPND 的菌株后，不仅在目标肝胰腺中，而且在胃和血淋巴中也能检测到 Vp_PirA 类和 Vp_PirB 类毒素 [13]。这一发现表明引起 AHPND 的菌株在 P. vannamei 中具有更广泛的组织趋向性，这可能有助于疾病的快速进展和严重程度。
一个敏感且强大的免疫系统对于生物体的疾病预防和病原体清除至关重要。与脊椎动物不同，甲壳类动物的免疫系统具有根本性的差异。这种差异主要源于它们缺乏能够产生持久、抗原特异性适应性免疫的专用免疫细胞 [14]。尽管缺乏适应性免疫系统，甲壳类动物依赖于先天免疫机制来有效抵御病原体的入侵 [15]。这些防御机制包括由几丁质外骨骼提供的物理屏障，以及两个高度相互关联的、由血细胞介导的组成部分：体液免疫和细胞免疫反应 [16]。
甲壳类的体液免疫是由血细胞分泌到血淋巴中的效应分子介导的。这种免疫方式包括多种可溶性分子，如酶、抗菌肽 (AMPs)、凝集素和凝血因子。这些分子可以在不依赖细胞免疫的情况下直接与病原体相互作用，在宿主防御中发挥关键作用 [17], [18]。AMPs 是先天免疫系统的重要组成部分，是体液免疫的关键介质 [17], [18]。自 20 世纪末在甲壳类动物中发现以来，对这些天然广谱抗菌分子的研究迅速发展，揭示了它们的多样性和复杂性。AMPs 作为体液防御的中心元素，是小型、广谱的肽类物质，主要通过破坏病原体的膜完整性来发挥作用。因此，最近的研究越来越多地集中在鉴定和表征新的甲壳类 AMPs 以及阐明它们的作用机制上。这些研究不仅推进了对甲壳类动物免疫系统的理解，还找到了开发新型治疗剂的潜在候选物质。几个主要的 AMP 家族已经在甲壳类动物中得到研究，包括抗脂多糖因子 (ALFs)、crustins 和溶菌酶 [19], [20], [21], [22], [23], [24]。在抗生素耐药性日益严重的今天，ALFs 的独特作用机制可能有助于降低细菌产生耐药性的倾向。这种先天的广谱活性使得 ALFs 成为了对抗多重耐药细菌的有希望的候选物质。从结构上看，ALFs 通常具有两个保守的半胱氨酸残基，它们形成一个二硫键，从而稳定一个保守的脂多糖结合域 (LBD) [25], [26], [27], [28]。然而，ALFs 如何抵抗 Vibrio 感染的确切机制仍不甚清楚。
在这项研究中，我们使用了 V. para 感染 P. vannamei 的模型，发现抗菌肽 ALF-like 对细菌具有反应性。在感染过程中，ALF-like 被证明可以直接结合 V. para、Staphylococcus aureus 和 Escherichia coli 的脂多糖和肽聚糖，发挥中和和抗菌作用。功能验证表明，ALF-like 基因的敲低显著增加了 V. para 的负荷，并降低了虾的存活率。同时，它提高了血细胞和血浆中的活性氧 (ROS) 和 H2O2 水平，并诱导了前列腺酚氧化酶 (proPO) 和抗氧化酶基因（如 SOD, CAT, GST）的上调。相反，ALF-like 基因的过表达显著提高了宿主的存活率，抑制了 V. para 的繁殖，并有效维持了 ROS 水平。总的来说，这些结果系统地揭示了 ALF-like 在病原体识别、直接抗菌作用以及调节宿主免疫和 ROS 方面的多功能作用。这项研究为阐明甲壳类动物抵抗 Vibrio 感染的免疫调控机制提供了关键证据。
章节摘要
实验动物和细菌接种
健康的 P. vannamei，平均体重为 3.6 ± 0.45 克，来自中国潍坊的 Bangpu 种子工业技术有限公司。实验前，虾在盐度为 29‰、温度为 26 ± 1 °C 的循环水系统中适应了 3 天。适应期间，每天两次喂食商业饲料。所有动物实验均按照黄海动物伦理委员会批准的方案进行
ALF-like 对 V. para 感染的反应
ALF-like 蛋白质包含一个预测的信号肽和一个保守的 23 个氨基酸组成的脂多糖结合域 (LBD)，该域位于 56 至 79 位之间的残基上。这个 LBD 在来自不同甲壳类物种的 ALF 同源物中都存在，包括虾、螃蟹、鲎和龙虾 (图 1 A)。三维结构预测显示 ALF-like 蛋白质中存在一个跨膜段 (图 1 B)。结构域分析确定了一个由 24 个残基组成的信号肽（位置 1-24），以及两个
讨论
在这项研究中，我们系统地研究了 Penaeus vannamei 中的 ALF-like 在对抗 V. para 感染中的免疫功能和调控机制。ALF-like 属于 AMP 家族，在甲壳类动物的先天免疫中起着重要作用 [33]。我们的研究发现，在 V. para 感染后，ALF-like 在血细胞、肝胰腺、鳃和肠道中的表达显著增加，表明它在宿主对抗病原体入侵的免疫反应中起着广泛的参与作用
结论
在 P. vannamei 对抗 V. para 感染的免疫防御中，抗菌肽起着关键的调控作用。本研究发现，Penaeus vannamei 中的 rALF-like 蛋白质可以直接识别并结合细菌表面的 LPS 和 PGN，表现出广谱抗菌活性。ALF-like 基因表达的敲低显著降低了虾的存活率，增加了细菌负荷，并导致血细胞和血浆中的 ROS 和 H2O2 水平急剧上升，表明这种物质
CRediT 作者贡献声明
杨冰冰：原始草案、方法论、正式分析、数据管理、概念构思。张莉：可视化、验证、软件、研究。倪佳：验证。薛倩：方法论。傅芳辉：软件。罗坤：研究。栾生：软件、概念构思。孔杰：监督、方法论。傅强：概念构思。曹家旺：软件。陈宝龙：方法论。戴平：研究。邢群：可视化、研究。李旭鹏：监督，
致谢
本工作得到了国家海洋渔业生物育种与可持续产品重点实验室（BRESG202401）、中国国家重点研发计划（2022YFD2400205）、山东省重点研发计划（2024LZGC038）、中国农业研究系统（CARS-48）以及中央公益性科学机构基础研究基金 CAFS（2023TD27）的财政支持。
杨冰冰|张莉|倪佳|薛倩|傅芳辉|罗坤|栾生|孔杰|傅强|曹家旺|陈宝龙|戴平|邢群|李旭鹏|孟贤红
