一种新型鹿茸来源抗氧化肽通过调节 Keap1/Nrf2 通路保护 HT22 细胞免受 H2O2 诱导的氧化应激

《Food Bioscience》：A novel velvet antler-derived antioxidant peptide protects HT22 cells against H 2O 2-induced oxidative stress through regulation of the Keap1/Nrf2 pathway

　　

## 摘要

鹿茸是一种富含蛋白质的动物源性材料，近年来作为生物活性肽的来源引起了越来越多的关注。当鹿茸蛋白经酶解水解时，会释放出多种具有抗氧化活性的肽。然而，在氧化应激条件下高效筛选具有潜在活性的肽仍面临挑战。本研究以鹿茸蛋白为原料，利用碱性蛋白酶进行水解。通过超滤、Sephadex G-15凝胶过滤和LC-MS/MS分析，鉴定出8个肽片段。随后进行了分子对接和分子动力学模拟。针对Keap1蛋白的对接分析显示，在8个肽中，LTDNVDENLTK表现出最有利的预测结合能（-13.47 kcal/mol）。进一步100 ns的分子动力学模拟证实了LTDNVDENLTK-Keap1复合物的结构稳定性，平均RMSD约为0.25 nm，形成11.52个氢键。在H2O2诱导的氧化应激条件下，LTDNVDENLTK显著提高了HT22细胞的存活率，降低了SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例，并抑制了p21和p53蛋白的表达。同时，它缓解了H2O2引起的G0/G1期阻滞并减少了凋亡。通过进一步降低Keap1表达并促进Nrf2核转位，LTDNVDENLTK提高了HO-1和NQO1蛋白的表达，恢复了CAT活性（从11.70到20.10 U/mg蛋白）和SOD活性（从9.74到20.53 U/mg蛋白），维持了GSH-Px水平（从20.00到28.07 U/mg蛋白），并降低了MDA水平（从12.52到8.46 nmol/mg蛋白）。这些发现为将LTDNVDENLTK作为潜在的来源于功能性食品的抗氧化肽进行进一步研究提供了初步证据。

## 引言

衰老是一个不可逆的自然生理过程，其特征是各组织和器官在形态结构、代谢功能和调控网络方面逐渐衰退，如线粒体功能障碍、蛋白质稳态失衡和表观遗传变化等（Guo等，2022）。随着全球老龄人口的增加，衰老被认为是21世纪社会框架和公共健康的重大问题（Gianfredi等，2025）。在影响衰老过程的诸多因素中，氧化应激起着尤为关键的作用（Fang等，2026）。它源于活性氧物种（ROS）的生成与清除之间的失衡，可损害脂质、蛋白质和DNA（Wen等，2025），从而加速组织功能衰退，阻碍健康衰老（Ademowo等，2024）。预防氧化应激、增强内源性抗氧化防御或直接清除多余的ROS，可有效保护细胞活力并延长细胞的健康寿命（Li等，2021；Liu等，2022）。因此，迫切需要加速开发能够有效调控抗氧化信号通路的生物活性肽，作为延缓脑细胞衰老和减轻氧化应激所致细胞损失的干预手段。细胞抵御氧化应激的核心是Keap1-Nrf2/ARE信号通路（Qi等，2023）。具体而言，Keap1蛋白作为该通路中的关键负性调控因子，在静息状态下通过结合并抑制Nrf2的活性发挥作用。而在氧化应激条件下，其构象变化或修饰导致Nrf2释放，从而激活下游ARE介导的抗氧化蛋白HO-1和NQO1的转录，最终维持胞内氧化还原稳态（Y. Zhang等，2024）。作为氧化还原通路中的关键分子开关，Keap1蛋白通过管理Nrf2的稳定性和功能，对维持胞内氧化还原平衡至关重要。海马是脑区中最易受氧化应激和细胞衰老影响的区域之一，这与年龄相关的认知下降和神经退行性疾病密切相关（J. Selva-Clemente等，2024）。HT22细胞是一种永生化的小鼠海马神经元细胞系，已被广泛用作研究氧化应激诱导的神经元衰老和评估潜在神经保护剂的体外模型（Maharajan等，2023）。H2O2处理HT22细胞可诱导经典的衰老表型，包括SA-β-半乳糖苷酶活性增加、p21和p53上调、G0/G1期阻滞和凋亡升高，使其特别适合于研究抗氧化肽的抗衰老活性。

近年来，在功能性肽领域，人们对源自蛋白质的抗氧化肽的研究兴趣日益增长（Lv等，2022；Zhang等，2025）。值得注意的是，来源于食品动物蛋白的抗氧化肽相比合成抗氧化剂具有分子量大、易吸收和成本低廉等优势，因此在延缓衰老方面广受欢迎（Ng等，2024；Xiang等，2023）。先前的研究报告了从动物蛋白中获得的抗氧化肽，包括来源于牦牛骨（Cao等，2025）、金枪鱼（Guo等，2024）、骆驼骨（Wang等，2023）和日本鹿（Cervus nippon）（Meng等，2025）的肽。日本鹿是人类食用动物蛋白的典型来源；可从其骨骼（K. Zhang等，2024）和血液（Ding等，2022；Yi Li等，2025），尤其是鹿茸（Jiang等，2025）中提取蛋白质，制备抗氧化肽。现代医学研究发现，鹿茸具有抗氧化、抗炎、抗骨质疏松、抗神经退行性变、抗肿瘤和免疫调节等特性（Xia等，2022）。根据研究，鹿茸蛋白含有全面的氨基酸谱，包含所有必需氨基酸。它特别富含支链氨基酸如亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val），以及脯氨酸（Pro），并且还含有高浓度的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）（Chen等，2024）。在这些氨基酸中，疏水性氨基酸（Leu、Val、Pro）有助于肽片段插入细胞膜的脂质双层或与其疏水口袋结合（Cai等，2023）。这与He等先前研究中关于抗氧化肽的发现一致，表明鹿茸肽可能是发现新型抗氧化肽的重要来源（He等，2025）。Chen等发现鹿茸肽可通过调节BDNF/PI3K/Akt信号通路，减轻D-半乳糖诱导的神经元损伤并抑制促炎因子和氧化应激产物的产生（S. Chen等，2025）。在信号通路水平上，鹿茸肽已被证明可通过激活Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化作用。鹿茸中活性成分的抗氧化特性归因于多种化学成分（如肽、磷脂和脂肪酸）和多种生物学通路（包括Nrf2/HO-1、EGF/EGFR和NF-κB）（Zhang等，2026）。

尽管上述研究取得了重大进展，但从鹿茸蛋白中生产抗氧化生物活性肽的研究仍处于初级阶段，对其功能活性和机制的探索有限。特别是，缺乏系统的实验证据阐明鹿茸中特定低分子量肽片段如何与Keap1蛋白相互作用以激活Nrf2介导的抗氧化反应。此外，从鹿茸蛋白中鉴定出的具有明确序列和抗氧化活性的单个肽数量有限；大多数研究仍局限于粗提物或肽混合物。现有研究主要关注鹿茸肽的整体药理学效应，而缺乏对单个肽的结构-活性关系及其在H2O2诱导的急性氧化应激损伤神经元细胞模型中保护作用的深入研究。

本研究以鹿茸蛋白为主要原料。在测试的六种蛋白酶中，选择了碱性蛋白酶进行水解。利用超滤、Sephadex G-15凝胶过滤和DEAE-52纤维素阴离子交换层析纯化并鉴定新型抗氧化肽，随后进行LC-MS/MS分析。随后针对Keap1蛋白进行了分子对接和分子动力学模拟以评估结合能力，并选择活性最高的肽（LTDNVDENLTK）进行进一步验证。该研究探讨了其高抗氧化活性的潜在原因。通过化学方法评估了其抗氧化性能，并评价了其对HT22细胞中H2O2诱导的氧化损伤的保护作用。利用Western blot分析探讨了其机制。本研究旨在为LTDNVDENLTK在功能性食品中的应用奠定基础，并为对抗氧化应激相关衰老提供新的候选抗氧化肽分子。

## 实验部分

### 材料与试剂

新鲜的鹿茸于春季采收期（4月至5月）从吉林省长春市双阳鹿茸养殖场采集的日本鹿（Cervus nippon Temminck）获得，鹿角生长约60天。鹿角在快速生长期采收，去除表面毛发和结缔组织后立即进行处理。整个研究使用同一批鹿茸（批次号SVF-2025-03）以确保起始材料的一致性。HT22细胞（一种小鼠……

### 超滤、纯化及抗氧化活性评估

蛋白酶的特异性直接影响水解产生的游离氨基酸和肽的大小、数量、组成和氨基酸序列，从而影响水解产物的生物活性（Chen等，2023；Shazly等，2019）。因此，选择合适的蛋白酶是提取生物活性肽的最重要因素。我们以DH（水解度）和抗氧化活性为评价标准，筛选了最适合VAP（鹿茸蛋白）的蛋白酶。图1B……

## 结论

本研究通过体外蛋白酶解、LC-MS/MS鉴定、分子对接和分子动力学模拟，成功从鹿茸水解物中鉴定了一种新型抗氧化肽LTDNVDENLTK。在鹿茸蛋白水解物中发现了8个肽片段，其中LTDNVDENLTK通过与Keap1蛋白的分子对接被预测为最佳的抗氧化肽。该肽与Keap1的结合能为-13.47 kcal/mol，表明其……

## 出版同意书

不适用。

## CRediT作者贡献声明

陈伟佳：监督、软件。耿建安：资源、项目管理。田岚实：方法学、调查研究、资金获取。刘金泽：撰写-初稿、形式分析、数据管理、概念化。周佳：撰写-审阅与编辑。何中美：撰写-初稿。

## 未引用参考文献

Chen等，2025；Chen等，2025；Li等，2025；Li等，2025；Vidal-Limon等，2022；Zhang等，2024。

## 数据可用性

本文章所述研究未使用数据。

## 伦理批准与参与同意

不适用。

## 利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

## 资金

本项目由三江实验室科技创新项目（SJ2025012-2）和归芪神口服液二次开发项目（SJ2025012-3）资助。

## 利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所报道的工作。

刘金泽|田岚实|耿建安|陈伟佳|何中美|周佳

吉林农业大学三江实验室，长春 130118，中国