戊二醛交联南极假丝酵母脂肪酶B负载于氨基UiO-66：一种合成二酰甘油的高效生物催化剂

《Food Chemistry》：Glutaraldehyde cross-linked Candida antarctica lipase B on NH?-UiO-66: A high-efficiency biocatalyst for diacylglycerol synthesis

　　

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  CALB@GA-NH₂-UiO-66实现了97.31%的油酸转化率和77.60%的DAG含量。
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  CALB@GA-NH₂-UiO-66在11次重复使用循环后仍保持全部初始活性。
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  固定化的CALB表现出单一的构象盆地。
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  通过席夫碱连接形成了共价酶-载体共轭物。
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  固定化适度限制了CALB的α-螺旋5的柔韧性。

引言

二酰甘油（DAG）是一种功能性脂质，因其在减少体内脂肪堆积、降低餐后血清甘油三酯和改善骨骼健康方面的作用，在健康食品和制药行业中日益受到青睐（Lai等，2022；Lee等，2020；Li等，2021）。DAG可通过化学或酶法路线生产。传统化学路线通常涉及高温，与富含多不饱和脂肪酸的油脂不相容，同时导致高能耗和深色产品（Zheng等，2023）。即使是Jacobs等报道的使用醋酸钾的催化剂方案，虽然可产生颜色较浅的粗DAG，但仍需要190–240 °C，因此仍然能耗较高（Lo等，2008）。酶法具有一些吸引人的优势：它们在温和的反应条件下运行（环境温度、常压和生理pH），表现出极高的催化效率和化学/区域/对映选择性，并且伴随最少副产物和低能耗，所有这些都使其更绿色且更具成本效益（Zheng等，2023）。然而，游离酶很少能在连续的工厂操作中存活很长时间：它们会变性、难以分离且无法回收。固定化巧妙地克服了这些缺点：它将酶锚定以供重复批次使用，可立即停止反应，并且通常能提高活性、稳定性或选择性，即使在非水溶剂中也是如此（Babaki等，2016；Zhong等，2019）。

当前的固定化技术大致分为两大类：无载体固定化和基于载体的固定化（Ma等，2025）。基于载体的方法，包括吸附、共价结合和包埋，代表了成熟的技术，利用外部固体材料为酶提供附着位点和稳定的微环境（Liu & Dong，2020）。相比之下，无载体固定化通过形成交联酶聚集体（CLEAs）消除了对外部支撑物的需求（Chen等，2023；Costa等，2023）。尽管CLEAs制备更简单且具有更广泛的适用性，但它们通常机械强度不足，这限制了其在工业环境中的实用性（Ma等，2025；Sheldon等，2005；Yamaguchi等，2018）。

共价固定化在酶与载体官能团之间形成稳定的化学键，显著提高了脂肪酶的机械和操作稳定性（Wang等，2024；Yang等，2010）。例如，Gao等人用壳聚糖对介孔SBA-15进行功能化，然后通过戊二醛（GA）介导的席夫碱交联将脂肪酶共价锚定到载体上，从而防止酶渗漏。所得的交联玫瑰色酵母脂肪酶（CRL）表现出优异的重复使用性，在48小时内经过6个循环后仍保持80.5%的初始活性（Gao等，2010）。

氨基功能化的载体，如介孔二氧化硅、磁性纳米颗粒和金属有机框架（MOFs）——由于其丰富的表面官能团、可调节的孔隙率和潜在的界面活化效应，为共价固定化提供了有吸引力的平台（Gao等，2010；Jafari Khorshidi等，2016；Zisis等，2015）。其中，氨基标记的MOF NH₂-UiO-66具有卓越的耐水热稳定性和高密度的NH?基团。这些残基容易与GA反应产生牢固的席夫碱连接，从而增强了所附着脂肪酶的机械强度和操作稳定性（Sheldon等，2005）。Chen等人表明，共价锚定到NH?-UiO-66上的脂肪酶AYS（AYS@NH?-UiO-66）在重复批次反应中优于其基于吸附的对应物（Chen, Sun等，2020）。GA的优点在于其双醛结构：它在载体上的氨基与酶上的赖氨酸ε-NH?之间架起桥梁，通过多个席夫碱键创建密集且稳定的"载体-酶"网络（Quiocho & Richards，1964；Yang等，2010）。

尽管几项研究报告称GA介导的交联可以有效提高酶稳定性，但酶固定化必须超越稳定性提高——它还应该旨在提高催化活性，并且理想情况下提高底物或产物选择性。然而，GA交联提高酶稳定性、活性和选择性的分子机制仍知之甚少，尚未得到系统研究。

甘油和脂肪酸的酶法酯化是DAG制备的主要途径。然而，除了DAG之外，酯化反应还会产生单酰甘油（MAG）和三酰甘油（TAG）。因此，要通过酶法酯化高效制备DAG，不仅需要使用高活性的固定化脂肪酶来促进脂肪酸（底物）的转化，还必须增强酶体系对DAG的选择性，从而增加其在最终产品中的比例。此外，固定化脂肪酶必须表现出良好的稳定性，以允许在多个反应循环中重复使用。

在本研究中，偏脂酶B（CALB）被共价固定化在氨基功能化的锆基金属-有机框架（NH?-UiO-66）上。通过调节交联参数（包括硫酸铵饱和度、GA浓度和交联时间）对固体催化剂进行了系统优化。通过包括X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、Brunauer-Emmett-Teller（BET）分析在内的综合材料表征阐明了酶-载体相互作用机制。随后将所得的CALB@GA-NH?-UiO-66催化剂应用于DAG的合成。反应条件得到了优化，并且严格评估了固定化CALB的可重复使用性。此外，研究了固定化CALB的热力学性质。为阐明GA交联赋予的活性、选择性和稳定性提高的分子机制，进行了分子动力学模拟。本研究旨在开发一种高效的固定化脂肪酶体系，该体系具有通过酶法酯化合成DAG的良好催化活性、稳定性和选择性，既提供了实用的生物催化剂，也为高性能酶体系的理性构建提供了理论指导。

文章片段

材料与试剂

GA（50%）、乙酸（≥99.9%）、2-氨基对苯二甲酸（ATA，>98.0%）、四氯化锆（ZrCl?，98%）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF，99%）购自阿拉丁化学公司（中国北京）。甘油（99.0%）、磷酸二氢钠（分析纯）、十二水磷酸氢二钠（分析纯）和绝对乙醇（≥99.7%）来自中国国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。无水甲醇（≥99.5%）由广州提供

交联CALB相对于吸附CALB的卓越性能

首先评估了通过物理吸附固定的CALB的催化性能作为基线。根据第2.3节中描述的酯化条件，吸附酶CALB@NH?-UiO-66在相同条件下达到了68.3%的油酸转化率和47.0%的DAG含量。

形成鲜明对比的是，通过GA交联共价固定的CALB（CALB@GA-NH?-UiO-66）在相同条件下达到了97.3%的油酸转化率和77.6%的DAG含量。转化率和选择性的同时提升

结论

在本研究中，通过GA介导的共价固定化将CALB固定化到NH?-UiO-66上，成功开发了一种用于通过酯化合成DAG的坚固且高效的生物催化剂（CALB@GA-NH?-UiO-66）。对交联方案和酯化条件进行系统优化使固定化酶实现了97.31%的油酸转化率和77.60%的DAG含量，同时表现出卓越的操作稳定性，在11次连续重复使用循环后没有检测到活性损失。这些性能

CRediT作者贡献声明

Jiawei Zheng：撰写——初稿、方法学、调查。Xuan Hu：正式分析、数据整理。Jiufang Chen：验证、数据整理。Fengxia Lan：验证、正式分析。Li Xu：项目管理、方法学。Zeping Lu：可视化、软件。Binbin Nian：可视化、软件。Nanjing Zhong：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、资源、项目管理、方法学、资金获取、概念化。

出版同意

不适用（本手稿中未呈现个人人体图像或可识别的个人数据）。

伦理批准和参与同意

本研究中未进行人体或动物研究。

关于生成式AI和AI辅助技术在写作过程中使用的声明

生成式AI工具（ChatGPT-4）在本手稿中仅用于英语语言润色。没有研究内容、数据分析或论证是由AI生成的。所有修订文本均由作者进行了全面检查和修订，他们对本文的所有内容承担全部责任。

资金

本工作得到国家自然科学基金（22571049）和广州市科技计划项目（2025D04J0052）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能会影响本文所报道的工作。

致谢

本工作的资金来自广州市科技计划项目（2025D04J0052）和国家自然科学基金（22571049）。

Jiawei Zheng|Xuan Hu|Jiufang Chen|Fengxia Lan|Li Xu|Zeping Lu|Binbin Nian|Nanjing Zhong