结合5 Da同位素标记策略与新型二元基质2-氨基间苯二甲酸/α-氰基-4-羟基肉桂酸用于MALDI-TOF-MS中水果N-糖组的准确定量

《Food Chemistry》：A 5-Da isotope labeling strategy combined with a novel binary matrix 2-aminoisophthalic acid/α-cyano-4-hydroxycinnamic acid for accurate fruit N-glycome quantification in MALDI-TOF-MS

　　

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  通用 5-Da 标记法为准确的 N-糖组分析创建内标。
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  新型基质 2-AIA/CHCA 确保均匀共结晶和高重现性。
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  H3N2F1X1 是果实冷胁迫的跨物种候选生物标志物。

Introduction

N-糖基化是调节真核生物蛋白质结构和功能的关键翻译后修饰 (PTM) (Gloster, 2014; Lairson, Henrissat, Davies, & Withers, 2008; Schjoldager, Narimatsu, Joshi, & Clausen, 2020)。植物 N-聚糖展现出显著的结构多样性，从高甘露糖、杂合、复杂到低甘露糖类型，其丰度随发育和环境胁迫而波动 (Burn et al., 2002; Strasser, 2016)。在胁迫适应中已显现出一个关键作用，其中 N-糖基化可以调节蛋白质折叠和降解，以减轻冷、热、干旱和盐度的影响 (Hashiguchi & Komatsu, 2017; Nozaki et al., 2012)。尽管其重要性，N-糖基化调节环境反应的精确机制在很大程度上仍未知，使得准确定量 N-聚糖异构体对于胁迫反应的功能研究至关重要。

植物 N-糖组的全面表征仍然具有分析挑战。刚性植物细胞壁阻碍了糖蛋白提取，而丰富的次级代谢物往往干扰纯化和检测 (Xiao, Sun, Suttapitugsakul, & Wu, 2019)。许多糖蛋白的低丰度和聚糖固有的差电离效率加剧了这些问题 (Li, Jiao, Cai, Zhang, & Lu, 2015; Shinohara, Furukawa, Niikura, Miura, & Nishimura, 2004)。与其他植物组织相比，果实糖组学面临更大的挑战，这是由于蛋白质含量极低，并被果胶、有机酸和色素等干扰化合物的复杂基质稀释 (Song et al., 2011; Zhang et al., 2020)。因此，迫切需要一种稳健且通用的定量方法来研究果实发育和胁迫生理中 N-糖基化的分子机制。

带有飞行时间检测的基质辅助激光解吸/电离质谱 (MALDI-TOF-MS) 是一种广泛用于碳水化合物分析的技术，因其软电离、高敏感性和操作简单 (Harvey, 2023; Ruhaak, Xu, Li, Goonatilleke, & Lebrilla, 2018; Zhou, Warren, Froehlich, & Lee, 2014)。通常，需要糖的全甲基化以提高 MALDI-TOF-MS 中的检测灵敏度。此外，性能高度依赖于 MALDI 基质，基质决定了检出限 (LOD) 和重现性 (Fukuyama et al., 2014; Zhao et al., 2017)。聚糖分析中最常见的基质 2,5-二羟基苯甲酸 (DHB) 以“甜斑”现象而闻名。DHB 形成大的针状晶体，导致分析物分布不均匀和信号重现性差，这严重限制了其用于准确定量的实用性 (Stahl, Steup, Karas, & Hillenkamp, 1991)。促进均匀共结晶的新型基质对于推进定量植物 N-糖组学至关重要。

除了 MALDI 基质之外，同位素标记是相对定量 MALDI-TOF-MS 的关键方面。化学、代谢和酶促标记等策略产生与样品共同分析的内标 (IS)，减轻了电离效率和仪器响应的变化 (Cao et al., 2015; Zhang et al., 2015)。然而，哺乳动物中的现有方法对植物 N-糖组学有限制。它们通常需要广泛的样品处理，导致回收率低，而且为细胞中哺乳动物聚糖设计的代谢标记方案并不总是与植物组织特异性结构兼容 (Kang, Mechref, Kyselova, Goetz, & Novotny, 2007; Orlando et al., 2009)。此外，胰蛋白酶酶促 ¹⁸O 标记产生的质量偏移仅为 2-Da，这经常导致来自天然同位素聚糖簇的同量异构干扰，损害相对定量准确性 (Liu et al., 2010; Qin et al., 2019)。因此，需要一种提供更大质量偏移且普遍适用于植物 N-聚糖的同位素标记策略。

跃变期果实采后生理学的研究具有重要的经济意义和科学意义。冷藏仍然是保持这些易腐商品质量和延长货架期的最有效策略 (Heyes, 2018)。然而，虽然冷储延缓了采后成熟，但它也可能诱发冷胁迫/冷害，这是一种会降低质量甚至造成重大经济损失的非生物胁迫 (Zhang, Jiang, Cao, & Jiang, 2021)。尽管其重要性，N-糖基化如何介导果实胁迫反应在很大程度上未被探索。阐明这些分子机制，包括冷诱导的 PTM 变化，对于推进保鲜技术至关重要。

为了克服这些分析障碍，我们在此建立了一种简单、通用且准确的果实 N-糖组相对定量方法 (图 1A)。开发了一种 5-Da 稳定同位素标记方法，结合对真实样品衍生聚糖的酶促 ¹⁸O 标记 (+2-Da) 和 NaBD?介导的还原 (+3-Da)，有效地消除了同位素重叠 (图 1B)。同时，我们开发了一种由 2-氨基间苯二甲酸 (2-AIA) 和 α-氰基-4-羟基肉桂酸 (CHCA) 组成的新型二元 MALDI 基质 (图 1A)。2-AIA/CHCA 基质为准确的 N-糖组定量提供了卓越的重现性和灵敏度。使用此集成平台，我们定量分析了跃变模型果实 (番茄和桃子) 采后储存期间的 N-糖组变化，揭示了一个与冷胁迫相关的保守下调 N-糖谱。

Section snippets

Plant materials and storage conditions

番茄 (Solanum lycopersicum L. cv. Ailsa Craig) 种植于浙江大学华家池实验站的温室中，收获处于成熟绿色 (MG) 阶段的果实。桃 (Prunus persica L. Batsch cv. Hujingmilu) 种植于浙江省宁波市奉化蜜桃研究所，收获达到商业成熟度 (S4) 的果实。选择大小均匀、颜色一致且无机械损伤的果实。

2-AIA is developed as an efficient MALDI matrix for N-glycan detection

众所周知，化合物在激光波长下的光学性质对其作为 MALDI 基质的有效性至关重要 (Liao et al., 2023)。因此，芳香羰基，一种常见的 MALDI 基质骨架，被用作我们工作中新型基质设计的核心结构。在引入羧酸基团作为发色团和引入氨基以促进电离后，选择了五个具有相同取代基的结构异构体作为候选者

Conclusion

总之，我们开发并验证了一种用于准确定量植物 N-糖组的稳健且通用的方法。该集成方法成功克服了基于 MALDI-TOF-MS 的 N-糖组学中的两个主要瓶颈：异质结晶和同量异构干扰。新型 2-AIA/CHCA 二元基质促进均匀样品沉积，导致高灵敏度 (fmol 检出限) 和出色的定量重现性 (RSD 6.04%)。同时，5-Da 稳定

CRediT authorship contribution statement

Hui-Wen Wang: 撰写 – 初稿，可视化，软件，调查，形式分析，数据整理。 Jia-Qi Wang: 撰写 – 初稿，可视化，验证，软件，方法论，数据整理。 Yue-Qiu: 可视化。 Tong-Hao Cui: 可视化，软件。 Jian-Cong Liao: 可视化，软件。 Yi-Long Liu: 调查。 Ya-Qin Liu: 调查。 Yuan-Jiang Pan: 资源。 Xian Li: 撰写 – 审阅与编辑，监督。 Xiao-Yong Zhao: 撰写 – 审阅与编辑，

Declaration of competing interest

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能看起来影响了本论文中报告的工作。

Hui-Wen Wang|Jia-Qi Wang|Yue-Qiu|Tong-Hao Cui|Jian-Cong Liao|Yi-Long Liu|Ya-Qin Liu|Yuan-Jiang Pan|Xian Li|Xiao-Yong Zhao