《Food Chemistry: X》：Quercetin-associated structural rearrangement and functional modulation of silkworm Pupa protein: Comparison of covalent and non-covalent interactions
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本研究考察了10–160 μmol/g蛋白浓度的槲皮素（Quercetin）通过共价与非共价相互作用对蚕蛹蛋白（Silkworm Pupa Protein, SPP）结构、界面性质及抗氧化性能的影响。结果表明，槲皮素掺入显著改变SPP功能行为，起泡能力（Foa
本研究考察了10–160 μmol/g蛋白浓度的槲皮素（Quercetin）通过共价与非共价相互作用对蚕蛹蛋白（Silkworm Pupa Protein, SPP）结构、界面性质及抗氧化性能的影响。结果表明，槲皮素掺入显著改变SPP功能行为，起泡能力（Foaming Capacity, FC）最大提高115.4%，乳化活性指数（Emulsifying Activity Index, EAI）较相应对照提高32.7%。中等槲皮素水平（Q40）在共价体系中提供最有利界面稳定性，乳化稳定指数（Emulsion Stability Index, ESI）由32 min升至46 min，而过量槲皮素降低泡沫与乳液稳定性。槲皮素掺入还明显增强SPP抗氧化能力，在Q160时，共价与非共价SPP-槲皮素体系中2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除活性分别提高4.35倍与4.08倍。傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）与扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）观察表明，槲皮素在分子与微观层面改变SPP结构组织，从而改善功能表现，且共价制备条件下变化更显著。总体而言，结果表明槲皮素结合可调控SPP结构与功能特性，改变程度取决于结合模式与槲皮素浓度。
研究背景方面，蚕蛹蛋白（Silkworm Pupa Protein, SPP）氨基酸组成均衡并含多种天然生物活性物质，但其溶解度有限、界面性质不足、加工中易受环境胁迫，限制了在食品中的应用。发酵虽可提升部分功能性质，但固有局限仍制约其作为功能性食品配料。多酚（Polyphenols）因芳香骨架与酚羟基具抗氧化、抗炎和免疫调节潜力；槲皮素（Quercetin）生物活性强，但水溶性低、口服吸收差。非共价复合物可逆且受pH、温度、离子强度影响，共价复合常需碱性或氧化条件，碱性本身也会改变蛋白构象。相较大豆蛋白、乳清蛋白等，SPP为成分复杂的昆虫源蛋白，芳香与亲核残基可及性不同，既有蛋白-槲皮素规律不能直接外推。现有SPP研究多聚焦提取、酶解与水提物生物活性，多酚介导功能改性研究少。因此，研究人员以SPP为对象，比较槲皮素共价与非共价结合对结构与功能的影响，论文发表于《Food Chemistry: X》。
关键技术方法上，样本为西北中国蚕桑基地所得蛋白含量≥95%的SPP粉；槲皮素经二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide, DMSO）溶解。研究人员构建共价体系（pH 9.0、25 °C、好氧12 h）与非共价体系（pH 7.4、氮吹厌氧2 h），随后透析除游离配体。主要方法包括福林-乔卡图法测总酚结合量、DTNB法测巯基（Sulfhydryl）、280 nm激发荧光光谱探芳香残基微环境、FTIR结合高斯拟合析二级结构、AutoDock Vina分子对接以低分子量脂蛋白3（Low molecular mass lipoprotein 3, LP3, UniProt: Q00802）为代表受体、粒度与ζ电位、SEM形貌、ANS探针测表面疏水性、BCA法溶解度、均质法泡沫性质、油-水均质体系测EAI与ESI。
2.3 槲皮素结合能力分析
研究人员用福林-乔卡图试剂定量总酚，依槲皮素标准曲线计算SPP-槲皮素复合物体外结合量，用以比较共价与非共价体系负载差异。
2.4 巯基含量测定
以Ellman试剂DTNB在412 nm检测，结合尿素促溶，研究人员发现槲皮素修饰改变SPP游离巯基水平，反映二硫键重排与氧化/共价交联程度。
2.5 荧光光谱
以280 nm激发、300–450 nm发射，研究人员观察到槲皮素结合引起色氨酸/酪氨酸微环境变化与内源荧光猝灭，提示结合位点邻近芳香残基。
2.6 傅里叶变换红外光谱
FTIR与PeakFit高斯拟合显示酰胺带位移，共价体系α-螺旋/β-折叠等二级结构比例变化更明显，说明槲皮素重塑蛋白骨架。
2.7 分子对接
以LP3为SPP代表组分，AutoDock Vina获得最优结合姿态，研究人员确认槲皮素通过氢键、疏水作用与π–π相互作用结合，仅用于探索非共价模式。
2.8 粒度与ζ电位
研究人员测得粒径分布与ζ电位变化，槲皮素引入改变表面电荷与聚集状态，共价体系聚合更显著。
2.9 扫描电子显微镜
SEM显示对照组结构较致密，SPP-槲皮素样品表面粗糙、孔隙或聚集体增加，共价组微观重排更强。
2.10 表面疏水性
ANS荧光斜率H0显示，中等浓度槲皮素提升表面疏水性、改善界面铺展，过高浓度致疏水基团包埋或聚集而下降。
2.11 溶解度
BCA法于pH 7.4测上清蛋白，研究人员发现适度槲皮素可改善SPP溶解度，与表面电荷及疏水重排有关。
2.12 起泡性质
均质法得FC与泡沫稳定性（Foam Stability, FS），Q40附近FC最大增115.4%，但过量槲皮素使FS下降。
2.13 乳化性质
以大豆油-蛋白均质体系测EAI与ESI，共价Q40的ESI由32 min升至46 min，EAI最大增32.7%；高浓度槲皮素因聚集或界面膜过荷降低稳定。
讨论与结论部分，研究人员指出非共价体系环境温和、变化可逆，共价体系因pH 9.0与好氧氧化引发去质子化、柔性增加及醌介导接枝，结构扰动更强。SPP中LP3等30 kDa脂蛋白家族占比高，芳香/亲核残基微环境使槲皮素结合模式异于乳源蛋白。中等浓度槲皮素在界面处平衡疏水暴露与网络形成，故FC、EAI与ESI最优；过量配体诱发交联过度、颗粒粗化、泡沫/乳液失稳。ABTS清除增强源于酚羟基电子供体与蛋白-多酚协同，非共价体系因游离酚羟基保留而仍具高活性。分子对接补充了非共价残基级相互作用证据，但不可证明共价接枝位。
结论部分译为：本研究考察了10–160 μmol/g蛋白浓度下槲皮素共价与非共价相互作用对蚕蛹蛋白（SPP）结构、界面性质及抗氧化性能的影响。结果显示，槲皮素掺入大幅改变SPP功能行为，起泡能力最大提升115.4%，乳化活性指数较对照提升32.7%；中等槲皮素水平（Q40）在共价体系中界面稳定性最佳，乳化稳定指数由32 min增至46 min，而过量化槲皮素降低泡沫与乳液稳定性。槲皮素明显增强SPP抗氧化能力，Q160时共价与非共价SPP-槲皮素体系ABTS自由基清除活性分别提高4.35倍与4.08倍。FTIR与SEM表明槲皮素在分子与微观层面改变SPP结构组织，改善功能表现，共价条件下变化更显著。综上，槲皮素结合可调控SPP结构与功能特性，改变程度取决于结合模式与槲皮素浓度。
