利用台式检测和分子建模研究热处理后11S大豆球蛋白与染料木素之间共价相互作用的机理

《Food Hydrocolloids》：Mechanistic investigation of covalent interactions between 11S soy glycinin and genistein following thermal treatment using benchtop testing and molecular modelling

　　

摘要

本研究利用光谱技术和计算机模拟方法的组合，探讨了热处理对95^oC下大豆球蛋白（11S）与大豆苷元（GNE）之间分子相互作用的影响。紫外-可见光谱分析显示，在添加配体并进行热处理后，吸收光谱发生了显著变化，表明可能发生了共价相互作用。MALDI-TOF/MS分析证实了这一结论，结果显示11S的酸性亚基上共价结合了六个GNE分子。加热显著增强了结合亲和力，以适用于该多价系统的结合位点为基础进行量化时，结合常数从常温下的2.5 x 10⁴ M^-1提高到了1.0 x 10⁵ M^-1。FTIR和CD分析表明，GNE的加入仅使11S的α螺旋和β折叠组分略微增加。对蛋白质进行模拟退火后进行分子对接分析，揭示了11S酸性亚基上六个GNE的结合位点，而这些位点在常温下是不可用的。量子力学计算证实，所有这些位点均能支持GNE与精氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺之间的共价键形成。这些发现阐明了热处理如何促进蛋白质-异黄酮的多价相互作用，并为设计食品加工策略以增强生物活性成分的结合提供了分子基础。

引言

由于营养价值高，特别是蛋白质含量高，大豆产品在人类饮食中已有数百年的历史。传统大豆食品包括豆腐、豆浆和酱油，然而，大豆出色的技术功能特性也使其成为各种配方中流行的增值成分，从烘焙食品到植物基肉类替代品不等（Sui等，2021）。通常，这些食品需要经过热处理以消除植物细胞、减少或抑制微生物生长、改善产品感官感知并提高货架稳定性。在此过程中，大豆蛋白质的功能特性，包括凝胶化、乳化和发泡能力，会发生改变，大豆蛋白质与系统中其他组分（如酚类化合物）之间的相互作用也可能得到增强（Chen等，2025；Lakemond等，2000）。

大豆蛋白质含有几种储存蛋白组分，即球蛋白组分glycinin（11S）、β-伴大豆球蛋白（7S）以及次要组分15S和2S。11S是大豆中含量第二丰富的储存蛋白，约占蛋白质总含量的30%，分子量约为360 kDa（Ren等，2019）。11S中共有5种不同的亚基（A1aB1b、A1bB2、A2B1a、A3B4和A5A4B3），每种均包含酸性（26-44 kDa）和碱性（14.4-22 kDa）多肽组（Singh等，2015）。这些酸-碱对通过单个二硫键连接在一起，并进一步通过疏水作用形成三聚体（Wu等，2021）。两个三聚体则堆叠在一起形成"甜甜圈状"的11S六聚体。在中性pH、常温及约0.5 M的离子强度下，11S以六聚体形式存在。然而，在碱性pH和60至95^oC的温度处理后，11S的三级结构开始松弛，可能暴露出先前隐藏的结合位点和氨基酸残基（Lakemond等，2000）。

除蛋白质外，大豆还是异黄酮的极佳来源，其浓度根据生长地区、成熟度和品种的不同在0.2-4.2 mg/g之间变化（Medic等，2014）。大豆中发现的主要异黄酮之一是大豆苷元（4',5,7-三羟基黄酮），成熟品种的含有量为5.6至276 mg/100g（Jaiswal等，2019）。GNE的摄入已被证明与心血管疾病风险降低、更年期症状缓解以及化学预防和抗氧化特性有关（Goh等，2022）。GNE是一种植物雌激素，与人体17β-雌二醇具有结构相似性，因此在体内发挥类雌激素功能（Sharifi-Rad等，2021）。由于GNE水溶性差，使用亲水胶体、胶束或纳米颗粒等载体可提高其生物利用度、掩盖不良感官特性，并保护GNE免受环境降解（Jaiswal等，2019）。

在常温和中性pH条件下，蛋白质和酚类化合物倾向于通过非共价机制相互作用，包括氢键、范德华力、疏水相互作用和静电作用（Ozdal等，2013）。共价相互作用可通过添加酶或在碱性环境中促进，鼓励酚类化合物氧化为反应性的醌和半醌中间体（Zhang等，2021）。通过这种方式，醌或半醌能够形成共价C-N或C-S键，这些键通常比非共价键更强且更耐环境因素（Yan等，2025）。例如在碱性条件下，11S能够通过共价相互作用与GNE和大豆异黄酮结合（Zhou等，2024）。

近期的研究表明，热处理也可以促进蛋白质与酚类化合物之间的共价相互作用（Abdollahi等，2023；Condict等，2019；Ince, Condict, Ashton等，2025）。这是因为热量可以诱导蛋白质三级结构的局部变性或展开，暴露出新的结合位点，使其能够与配体形成共价加合物。此外，酚类化合物可能在热诱导下氧化为高反应性的醌或半醌自由基（Condict等，2019）。在适当的热条件下，蛋白质和酚类化合物的结构变化可导致新暴露的亲核氨基酸的胺基或巯基与酚类化合物自由基之间形成共价相互作用（Zhang等，2021）。这些相互作用可能影响与各化合物相关的营养特性，特别是酚类化合物的抗氧化性质以及蛋白质的体外消化率或溶解度（Dai等，2023）。

大豆蛋白质和大豆异黄酮在中性条件下通过非共价方式相互作用，或在酶存在或碱性条件下通过共价方式相互作用（Rawel等，2002；Zhou等，2020b；Zhou等，2024）。我们之前的工作表明，在常温和接近中性的pH 7.4条件下，11S可在每个三聚体的疏水核心内容纳一个GNE分子，这种相互作用由非共价力稳定（Smith等，2023）。然而，热处理对这一相互作用的影响在大豆基系统中仍未得到充分探索。因此，本研究考察了大豆异黄酮大豆苷元在95^oC、30分钟热处理后，在接近中性的pH 7.4条件下与大豆11S glycinin的相互作用。

为此，本研究利用紫外-可见吸收光谱、CD光谱、FTIR干涉图和MALDI-TOF-MS/MS数据，评估芳香族吸收特性的潜在变化，并监测11S中亚基特异性的分子量变化。分子对接、分子动力学模拟和量子力学计算预测了热诱导的结合位点暴露，并提供了GNE与11S结合口袋内残基之间相互作用能的见解。本工作的结果旨在阐明热展开如何引导11S中的位点特异性酚类反应性。增强对蛋白质-多酚化学的预测控制将为设计下一代具有特定技术和生物功能性的加合物形成的大豆原料提供新的策略。

章节摘要

材料

脱脂大豆粉由Hela Foods（澳大利亚墨尔本）慷慨提供。大豆苷元购自Focus Bioscience（澳大利亚布里斯班）。Trizma?碱和Trizma? HCl粉末、ProteoMass?蛋白质MALDI-MS校准试剂盒、芥子酸和三氟乙酸购自Sigma-Aldrich（澳大利亚悉尼）。所有试剂均为分析纯级，并按照供应商说明进行配制。

Glycinin（11S）的分离

从脱脂大豆粉中分离11S的方法如Smith等人之前所述

11S和GNE的紫外-可见光谱

紫外-可见光谱检测到的分析物吸收差异，可以提供关于所发生相互作用类型的见解。例如，在添加配体并应用热量后蛋白质吸收峰的显著变化，通常指示存在共价相互作用（Kaur等，2018；Liu等，2017）。这些变化通常是由于酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）周围环境的改变所致，

结论

研究发现，热处理在促进大豆11S分子酸性亚基与大豆苷元之间稳定多价相互作用方面发挥了核心作用，促进了共价结合，同时基本保持了蛋白质的整体结构完整性。热诱导的构象重排似乎促进了多重共价配体结合，而这种情况在常温条件下是不存在的。这导致了结合亲和力的显著增强，而常温条件下

CRediT作者贡献声明

Stefan Kasapis：写作 – 审阅与编辑，监督，资金获取，概念构思。John Ashton：监督，资金获取。Lloyd Condict：写作 – 审阅与编辑，方法论，概念构思。Emelia Smith：写作 – 初稿撰写，方法论，调查研究，形式分析

未引用参考文献

Ince等，2025；Tang等，2024；Tang等，2024。

利益冲突声明

? 作者声明，他们没有已知的财务利益或人际关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究得到了澳大利亚研究理事会联合项目资助计划（项目编号LP190100175）和RMIT AWS云超级计算（RACE）的支持。

Emelia Smith|Lloyd Condict|John Ashton|Stefan Kasapis

澳大利亚墨尔本VIC 3083，RMIT大学科学学校，Bundoora West校区，Plenty Road