大麦醇溶蛋白分离物作为麸质定量的候选参考物质——一项概念验证研究

《Food Chemistry》：Barley hordein isolates as candidate reference materials for gluten quantitation – a proof-of-concept study

　　

八个大麦品种的掺混降低了蛋白质组成的变异性。研究人员制备了四种大麦醇溶蛋白分离物，用作候选参考物质（RM）。这些分离物的醇溶蛋白组成对面粉具有代表性。这些分离物可作为标准化大麦参考物质的合适候选物。

大麦是全球第四大谷类作物，其籽粒储藏蛋白——B、C、D和γ-醇溶蛋白——由于与小麦和黑麦中的麸质蛋白具有高度氨基酸序列同源性，可诱发乳糜泻（CeD）。无麸质食品的麸质限量标准为20 mg/kg，因此可靠检测残留麸质对保障CeD患者安全至关重要。常规检测多采用基于R5单克隆抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA），但现有商品化试剂盒的参考物质（RM）均以小麦为基体，导致对大麦醇溶蛋白的定量被高估约3.5倍、6倍乃至7–30倍，主要原因是R5单抗对含有多拷贝QQPFP表位的C-醇溶蛋白具有高亲和力。此前虽有研究提出含40% C-醇溶蛋白的RM来校正，但离子交换层析纯化C-醇溶蛋白耗时费力。因此，建立标准化大麦RM具有明确需求。该研究发表于《Food Chemistry》。

研究人员选用先前筛选的八个大麦品种（七个欧洲品种和一个加拿大品种）的第二个收获年份（2022年）等量混合作为起始材料，以混合方式削弱环境因素对蛋白组成的影响，制备四种大麦醇溶蛋白分离物，即醇溶蛋白、谷蛋白、麸质蛋白和乙腈/水可提取蛋白（AWEP），并通过凝胶电泳、色谱、质谱和免疫化学方法进行系统表征，评估其作为候选RM的可行性。该研究为建立标准化大麦RM提供了概念验证，有助于校正ELISA对大麦麸质的高估，提高无麸质食品标签的准确性。

研究采用的主要关键技术方法包括：以七个欧洲和一个加拿大大麦品种的2022年收获籽粒为样本来源，等量混合制粉；通过顺序提取和超滤/冻干制备四种蛋白分离物；利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和凝胶渗透高效液相色谱（GP-HPLC）分析蛋白组成与分子量（Mw）分布；采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证蛋白亚基谱带；使用R5单抗三明治ELISA测定各分离物的免疫反应性；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行发现蛋白质组学分析，结合MaxQuant/iBAQ定量，并检索R5表位、CeD相关CD4⁺ T细胞表位及潜在有害序列。

研究结果如下：

3.1 大麦面粉蛋白含量与组成：八个大麦品种的蛋白含量范围为7.4–18.1 g/100 g，平均值为10.4 g/100 g；麸质含量范围为5.0–15.9 g/100 g，蛋白含量与麸质含量强相关（Pearson r=0.997）。B/γ-醇溶蛋白平均占59.7%，C-醇溶蛋白占26.3%，D-醇溶蛋白占14.0%。同一品种在两个收获年份间多数存在显著差异，但混合物的整体醇溶蛋白谱仍保持代表性。

3.2 分离物得率与蛋白含量：从100 g面粉中，醇溶蛋白分离物得率为6.8 g，AWEP为2.9 g，麸质蛋白为5.5 g，谷蛋白为3.9 g。粗蛋白含量以AWEP最高（84.0%），其次为醇溶蛋白（81.1%）、麸质蛋白（74.2%）和谷蛋白（64.0%）。

3.3 分子量分布：SDS-PAGE显示四种分离物均在35–50 kDa区域出现B/γ-醇溶蛋白条带，麸质蛋白和谷蛋白分离物在约90 kDa处有较弱的D-醇溶蛋白条带，C-醇溶蛋白条带染色较弱。GP-HPLC表明AWEP和醇溶蛋白分离物的Mw分布与面粉中醇溶蛋白部分一致，谷蛋白分离物与面粉中谷蛋白部分一致，麸质蛋白分离物则兼具醇溶蛋白和谷蛋白的特征。

3.4 蛋白分布：RP-HPLC比较显示，各分离物与对应面粉部分的B/γ、C和D-醇溶蛋白比例总体相似。谷蛋白分离物中B/γ-醇溶蛋白比例（81%）高于面粉谷蛋白部分（71%），D-醇溶蛋白比例（10%）低于面粉部分（20%），这是分步提取过程中最后提取谷蛋白所导致的预期差异。

3.5 R5 ELISA响应：AWEP和醇溶蛋白分离物对R5单抗的响应最强，斜率分别为5.59和4.41；麸质蛋白分离物次之，斜率为2.65；谷蛋白分离物响应极弱，斜率仅0.16。这表明AWEP和醇溶蛋白分离物最适合作为ELISA的RM候选物。

3.6 蛋白质组学表征：LC-MS/MS共鉴定出1246条胰酶肽段，归属于396个蛋白群，其中20个为麸质蛋白，进一步归属为1个C-醇溶蛋白、1个D-醇溶蛋白、3个B-醇溶蛋白和4个γ-醇溶蛋白。iBAQ相对定量显示，麸质蛋白、AWEP和醇溶蛋白分离物中B-醇溶蛋白占63–64%，γ-醇溶蛋白占16–22%，D-醇溶蛋白占14–20%；谷蛋白分离物则富集D-醇溶蛋白，比例为39%。由于C-醇溶蛋白缺乏胰酶酶切位点，其检出强度很低。

3.7 潜在免疫反应肽：在所有鉴定肽段中，共发现12个潜在免疫反应肽，其中9个含有QLPQ、QQPQ或QLPA等潜在有害四肽基序，3个携带R5表位（QQPFP或QQPYP），未检出全长CeD相关CD4⁺ T细胞表位。

讨论部分总结指出，八个品种中七个品种的蛋白含量与文献报道一致，来自拉脱维亚的Kornelija因是唯一的裸大麦品种而蛋白含量较高。样品集未包含澳大利亚、阿根廷等其他主要大麦出口国品种，且缺乏农艺措施信息，是本研究的主要局限性。混合能有效代表八个品种并减少环境变异。GP-HPLC与RP-HPLC互为补充，但GP-HPLC无法清晰分离C-醇溶蛋白。产量方面，分步提取的总产量高于一步提取。R5 ELISA响应顺序为AWEP≈醇溶蛋白>麸质蛋白>谷蛋白。蛋白质组学能够区分B-和γ-醇溶蛋白，但胰酶对C-醇溶蛋白检测不足，可能低估其含量。潜在免疫反应肽主要来自B/γ-醇溶蛋白，与ELISA强响应一致。未检测到全长CD4⁺ T细胞表位可能与胰酶消化策略有关。此外，不同溶剂重溶分离物以及仅使用一种ELISA试剂盒也是需要进一步验证的局限性。

研究结论翻译如下：本研究表明，七个欧洲品种与一个加拿大大麦品种的混合可提供制备大麦醇溶蛋白分离物的起始材料，这些分离物对欧洲大麦总体具有代表性。虽然单品种在收获年份间表现出较高的遗传和环境蛋白含量变异性，但混合有效缓解了这些变化。通过互补方法的全面表征证实，醇溶蛋白、AWEP和麸质蛋白分离物在蛋白组成和分子量分布方面与原始大麦面粉相应组分相当，而谷蛋白分离物略有差异。由于在R5 ELISA中响应较强，AWEP和醇溶蛋白分离物被确定为最可行的RM候选物，其生产相对简单，更适合大规模实验室标准化。尽管胰酶水解证实了D、B和γ-醇溶蛋白存在于分离物中，但C-醇溶蛋白缺乏酶切位点突出了当前鸟枪法蛋白质组学的局限，可通过使用替代肽酶加以克服。这些充分表征的醇溶蛋白分离物为建立标准化大麦RM提供了概念验证，以校正ELISA检测中目前对大麦麸质的高估，确保更准确的标签标识，并增强CeD患者的食品安全。