定制的壳聚糖基阳离子碳量子点对多重耐药牛乳房炎病原菌的抗菌效能评估

《Food Control》：Evaluation of antimicrobial efficacy of tailored chitosan-based cationic carbon quantum dots against multidrug-resistant bovine mastitis pathogens

　　

摘要

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌（ESBL 大肠杆菌）是参与促进牛乳房炎的重要耐药菌。这些病原菌在牛奶中的存在会引发严重的食品安全问题。因此，评估新型有前景的抗菌剂以控制其生长和增殖已变得刻不容缓。碳量子点（CQDs）是一类新型纳米治疗剂，展现出有前景的抗菌潜力。本研究通过一步水热法，在180°C下加热10 h，以壳聚糖为碳源和掺杂剂合成了超强阳离子CQDs。合成的CQDs具有强正Zeta电位（+47.60 mV），并采用HR-TEM、DLS、UV–Vis、光致发光、ATR-FTIR、XRD、XPS、AFM和拉曼光谱对其进行了表征。CQDs呈准球形，平均直径为1.5 nm，具有半结晶特性。CQDs对MRSA和ESBL 大肠杆菌表现出优异的抗菌活性，MIC和MBC值分别为83.98 μg/mL和167.96 μg/mL。在CQD处理8 h和12 h后，分别观察到对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分离株的完全抑制作用。机制研究表明，细胞内ROS水平升高、膜孔形成及生物分子（蛋白质、还原糖和核酸）泄漏，提示氧化应激介导的膜损伤。此外，CQDs表现出剂量依赖性的生物膜抑制作用，以及显著的体外抗氧化和抗炎活性。CQDs无溶血性，对真核细胞表现出优异的生物相容性。总体而言，壳聚糖衍生的超强阳离子CQDs为遏制多重耐药乳房炎病原菌的生长提供了一种有前景的抗菌策略。然而，仍需进一步的体内试验来验证这些发现。

引言

碳量子点（CQDs）是一类粒径小于10 nm的新型荧光纳米材料。凭借其多功能特性，近年来引起了研究人员的极大兴趣。结构上，CQDs由表面功能化的碳核组成，呈准球形结构，包含含有石墨碳（sp²碳）或石墨烯和氧化石墨烯片层的无定形或纳米结晶中心，并通过sp³杂化碳键相互连接（Emam & Ahmed, 2021）。与金属纳米粒子相比，它们具有以下优势：可调节的光致发光、低细胞毒性、生物相容性、环境友好性、成本效益高、合成简便、优异的水分散性及丰富的表面化学性质，可实现杂原子掺杂。这些特性使它们成为探索生物医学应用的有前景的候选材料。CQDs表现出多种功能特性，包括抗菌、抗真菌、抗病毒、抗癌和抗氧化活性（Pechnikova et al., 2025）。此外，其在生物传感、生物成像和药物递送方面的应用也已被广泛研究（Azam et al., 2021）。另一方面，超强阳离子碳量子点（super-cationic CQDs）是指具有极高正表面电荷/Zeta电位的碳量子点，通常是由于其表面存在高密度的质子化胺基、季铵基、胍基或其他带正电荷的功能基团所致。这些高度正表面电荷促进了与带负电荷的生物膜之间的强静电相互作用，使其在抗菌和药物递送应用中特别有效（Jian et al., 2017）。

自上而下和自下而上的策略已被广泛用于CQDs的合成。这些方法涉及多种技术，如微波辅助处理、电化学剥离、热解、激光烧蚀和化学氧化（Yadav et al., 2023）。然而，它们存在某些固有的缺点，包括使用危险化学品和苛刻的反应条件。相比之下，水热法或溶剂热法绿色合成路线近年来备受关注，因为它们利用天然可再生的碳前驱体，提供了可持续且环境友好的替代方案（Maheshwari et al., 2025）。据报道，水热法合成具有以下优势：操作条件温和、环境影响小且成本低廉。此外，前驱体的碳化与表面钝化可在一步中完成，从而能够合成具有多样化且可调节功能的CQDs（Xie et al., 2025）。迄今为止，已使用多种生物质衍生前驱体进行CQDs的绿色合成，包括农业废弃物、食品废弃物、牛奶、乳清、蛋白质等（Elattar et al., 2025; Nataraj et al., 2025）。其中，多糖因其丰富的碳含量而成为合成CQDs的最佳前驱体。壳聚糖是由壳质衍生而来的葡糖胺和N-乙酰葡糖胺的共聚物，存在于甲壳类动物、真菌和昆虫的细胞壁中，也存在于某些藻类、微生物和一些无脊椎动物中（Abubakar et al., 2025）。此外，壳聚糖丰富的天然来源、结构多样性以及丰富的功能基团（羟基、羧基和氨基）促进了碳化和杂原子掺杂。此外，壳聚糖是一种可再生的阳离子生物聚合物，其氨基官能团在酸性介质中质子化，从而能与阴离子表面产生强静电吸引和氢键作用（Pellis et al., 2022）。

抗菌药物耐药性（AMR）已成为一种全球公共卫生紧急情况，也是源于兽药和公共卫生领域抗生素滥用的"同一健康"问题。乳房炎是一种主要因细菌感染引起的乳房炎症性疾病，其管理主要依赖抗生素治疗。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是与奶牛乳房炎病因学相关的重要细菌病原菌（Kumar et al., 2020）。由于长期滥用，这些细菌已对多种临床重要抗生素产生耐药性，导致出现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌分离株，这些菌株对传统抗菌治疗反应不佳（Weiner et al., 2015）。此类多重耐药（MDR）病原菌的出现和全球传播对公共卫生构成了严重威胁（无声大流行），并可能导致其通过食物链传播（Founou et al., 2021）。因此，食物链中的AMR已成为严重的食品安全问题。因此，抗菌药物的合理使用和探索有效的替代策略已成为兽医学和公共卫生领域的优先研究方向。这凸显了开发新型抗菌策略以减轻MDR病原菌增殖的迫切需要。

研究人员已探索了多种替代方案，如细菌素、益生菌、抗菌肽、噬菌体、精油、后生元、表面活性剂、纳米颗粒和草药提取物，以对抗MDR细菌的生长和增殖（Ruegg, 2025）。然而，由于其稳定性、功效、安全性和成本可行性方面的担忧，这些方法的实际应用仍受到限制。随着纳米科学和技术的进步，一些研究已调查了碳量子点（CQDs）对食品腐败和病原菌的抗菌功效（Collins et al., 2025）。尽管这些研究证明了CQDs的显著抗菌潜力，但其抗菌作用的潜在机制仍未得到充分阐明。鉴于这一知识空白，我们假设从壳聚糖合成的超强阳离子CQDs能与带负电荷的细菌表面相互作用，并可能对引起乳房炎的MDR细菌表现出抗菌活性。因此，本研究旨在以壳聚糖为前驱体合成和表征阳离子CQDs，并通过体外方法评估其对牛乳房炎相关MDR病原菌（ESBL 大肠杆菌和MRSA）的生物相容性、细胞毒性、抗菌潜力和作用机制。此外，牛乳房炎不仅以细菌感染为特征，还伴有宿主免疫系统产生的过度氧化应激和炎症反应。因此，还通过体外方法评估了CQDs的抗氧化和抗炎特性。

章节摘要

细菌培养物

金黄色葡萄球菌NK109（MRSA）和大肠杆菌7831（ESBL 大肠杆菌）此前从牛乳房炎乳中分离和鉴定获得，来自印度哈里亚纳邦卡尔纳尔ICAR国家乳业研究所奶品质量与安全国家参考中心。此前通过纸片扩散法进行的抗生素敏感性分析表明，大肠杆菌7831对氨苄西林、四环素、头孢西丁、头孢他啶等多种抗生素具有耐药性，

结果与讨论

壳聚糖是一种含有丰富–OH和–NH₂基团的线性多糖，通过脱乙酰化过程从壳质中获得。它由通过糖苷键连接的葡糖胺和N-乙酰葡糖胺单元组成。由于其固有的无毒、生物相容和可生物降解特性，以及相对低廉的价格，它被广泛应用于医药和制药行业。由于该生物聚合物富含碳原子并具有多个–OH和–NH₂功能基团，

结论

成功以壳聚糖作为碳前驱体和氮掺杂剂合成了超强阳离子CQDs。CQDs的高度正表面电荷和纳米级尺寸通过静电作用与细菌细胞相互作用，导致氧化应激、膜损伤和细胞内生物分子泄漏，从而促使其杀菌活性。CQD处理后8 h和12 h内，分别实现了对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分离株的完全抑制，

CRediT作者贡献声明

Basavaprabhu Haranahalli Nataraj：撰写——初稿，可视化，软件，资源，项目管理，方法学，调查，资金获取，形式分析，概念化。Shubham Vishwakarma：方法学，调查，数据整理。Vineet Manjunath：可视化，调查，形式分析，数据整理。Vandana Kamanahalli Venkataramanareddy：调查。Rashmi Hogarehalli Mallappa：撰写——审稿与编辑，可视化，验证，

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能会影响本文所报告的工作。

致谢

作者感谢ICAR-NDRI主任提供进行本研究所必需的设施支持。作者感谢Anusandhan国家研究基金会（ANRF）在ANRF-PMECRG（ANRF/ECRG/2024/000284/LS）资助下提供的经费支持。

Basavaprabhu Haranahalli Nataraj|Shubham Vishwakarma|Vineet Manjunath|Vandana Kamanahalli Venkataramanareddy|Rashmi Hogarehalli Mallappa|Heartwin Amaladhas Pushpadass|Avanish Singh Parmar|Raghu Hirikyathanahalli Vishweswaraiah

乳业微生物实验室，乳业加工部门，ICAR国家乳业研究所，南部区域站，印度卡纳塔克邦班加罗尔，560030