环糊精糖基转移酶与糖原分支酶协同制备高支链淀粉：对淀粉不同结晶形态的影响

《Food Hydrocolloids》：Synergistic preparation of highly branched starch by cyclodextrin glycosyltransferase and glycogen branching enzyme: influence on different crystalline forms of starch

　　

摘要

为了解决在非糊化体系中制备高支链淀粉时酶可及性和改性效率低的问题，本研究采用了一种双酶（GBE和CGTase）联合改性方法。研究发现，以环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase，120 U/g干淀粉）先处理、随后以糖原分支酶（GBE，300 U/g干淀粉）处理（C/G顺序）的酶添加顺序实现了淀粉的最优协同改性。结果表明，双酶处理显著提高了淀粉的支化度和聚合度（DP）小于13的短链比例，同时降低了其粘度、体外消化率和回生焓。C/G顺序处理使玉米淀粉（CS）、马铃薯淀粉（PS）和豌豆淀粉（PBS）的α-1,6糖苷键比例分别从4.45%、3.85%和5.66%提高到15.14%、9.10%和13.65%，其中CS表现出最佳的支化效果。此外，在相同处理顺序下，CS、PS和PBS的直链淀粉含量分别从26.51%、27.35%和31.3%降低至7.47%、11.58%和9.66%。改性还使CS的快消化淀粉含量降低了36.14%。峰值粘度从2316 cP降至1565 cP，回生值从678 cP降至仅3 cP，糊化焓（ΔH）从12.53 J/g降至4.94 J/g，比表面积增加。在双酶改性过程中，A型CS的结晶度降幅大于B型和C型淀粉。这种由C/G顺序破坏结晶区域和扩展多孔网络所驱动的结构松弛，是其支化度和功能特性增强的基础。本研究为通过酶改性优化工艺和工业化制备高支链淀粉提供了理论基础。

引言

高支链淀粉具有低粘度、抗回生和慢消化等特性，更适合当前的食品加工需求。它是一种具有高支链结构的多糖，其分子通过α-1,4糖苷键沿主链连接，并通过α-1,6糖苷键形成众多侧链分支，呈现树状或球状构型。这种结构赋予其显著的抗消化性，主要归因于其独特的分子特征。Kittisuban等人（2014）观察到改性木薯淀粉中抗性淀粉（RS）含量上升了13.5%，这与其高度支化的分子结构密切相关。提高淀粉支化度的主要方法包括物理、化学、酶法和基因工程方法（He等，2023）。与物理改性效果有限和化学改性存在安全风险相比，酶法改性因其底物特异性强、反应条件温和、环保以及能够精确调控淀粉分子结构等优势，成为提高淀粉支化度的首选方法。由于天然淀粉具有致密的颗粒结构，单一酶的转糖基活性难以有效接触底物，因此淀粉在酶改性时通常需要预糊化处理。糊化过程使淀粉颗粒吸水膨胀，导致结晶区崩解、双螺旋解离，暴露出更多糖苷键供酶作用，从而显著提高改性效率。然而，糊化完全破坏了淀粉的天然颗粒完整性，显著影响其关键特性，包括糊化和凝胶特性、流变行为、消化性、加工适用性、持水性和冻融稳定性以及回生特性。例如，Yu等（2021）发现糊化破坏玉米淀粉（CS）颗粒完整性后，双分支酶改性将快消化淀粉（RDS）从93.2%降至69.2%，提高了支化度并缩短了外链，显著改变了消化和结构特性。此外，据Essers等（2026）报道，糊化使马铃薯麦芽糊精成为均匀溶液；双酶同步催化使α-1,6支化度从9.8%提高到12.8%的同时增加了分子量，从而调节了结构和消化速率。Wang等（2023）报道糊化完全破坏了甘薯淀粉颗粒，双酶改性使支化度从12.02%提高到44.06%，回生速率降低了65.94%，显著优化了流变性和抗回生特性。尽管糊化体系提供了更高的改性效率，但会损害淀粉类食品的质地；因此，保留颗粒完整性的非糊化改性对于维持最终产品的口感至关重要。如何在非糊化状态下通过酶改性优化淀粉的各项特性已成为当前研究热点。

近期，多项研究报告了直接对非糊化或部分糊化体系中的淀粉进行酶法改性的尝试。Tian等人发现利用来自Petrotoga mobilis的糖原分支酶（GBE）对蜡质CS颗粒进行改性，将相对结晶度从28.9%降至约27.0%，表面有序度从0.59降至约0.52，RS含量从约5%显著提高到15%。Ding等（2025）证明利用麦芽糖化α-淀粉酶（MA）处理的纯支链淀粉大麦颗粒淀粉，支化度从7.3%显著增加到24.9%-27.3%，A型结晶度从35.4%降至16.1%-16.6%，表面有序度从0.78降至0.60。Zhu等证明利用Pyrococcus horikoshii OT3 GBE的热稳定突变体（H415W和T508K）在70°C下改性非糊化天然玉米淀粉（NCS）颗粒，直链淀粉含量分别从25.5%降至17.3%和17.8%，RDS含量分别从92.35%降至72.00%和72.89%，回生焓分别从6.81 J/g降至2.47 J/g和2.43 J/g（Zhu等，2024）。尽管上述研究在非糊化条件下淀粉酶改性方面取得了一定成果，但改性程度仍相对有限，与完全糊化体系中实现的高改性效率仍存在较大差距。

GBE作为一种关键的糖基转移酶，具有α-1,4糖苷键水解和α-1,6糖苷键转移活性（Ren等，2020）。Ren等（2017）发现GBE增加了α-1,6支化度并缩短了链长，改善了糊稳定性并延缓了回生。Jung等（2020）表明不同来源的GBE产生了不同链长（DP 6.65-14.1）的簇状支链淀粉，影响了解散性和消化性。这些结果强调了支链结构在决定淀粉功能特性方面的重要性。分支点可以通过断裂线性片段并重连形成，显著改变淀粉的链长分布和结晶特性。这一过程不仅改变了淀粉的分子构象并提高了支化度，还影响其功能特性，如降低消化性和改变糊化特性（Ren等，2017）。例如，研究表明GBE改性使淀粉中α-1,6糖苷键比例增加，A链（DP < 13，DP为聚合度）从24.87%升至28.23%，而B链（DP > 30）从20.46%降至11.95%。

近年来，催化淀粉分子内糖基化反应的环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase，EC 2.4.1.19）因其在淀粉改性中的应用而受到广泛关注，特别是在非糊化体系（<65°C）中。CGTase通过水解淀粉链的α-1,4糖苷键、将释放的线性片段形成环糊精（CD），选择性地改性淀粉主链的非晶区域，在保持颗粒完整性的同时调节消化性和功能特性。Ji等（2025）证明CGTase在低酶用量下优先靶向正常玉米淀粉颗粒的非晶区域，同时保持整体颗粒完整性，表现为相对结晶度增加和颗粒形态完整。Dura和Rosell（2016）发现CGTase优先攻击淀粉非晶区域同时保持颗粒完整性，产生的多孔淀粉抗淀粉酶能力降低。鉴于两者作用模式的互补性，我们假设CGTase和GBE可以协同增强淀粉支化。CGTase水解非晶区域产生线性葡聚糖底物，GBE断裂α-1,4糖苷键并通过α-1,6键重新连接链段，增加支化密度。这种"先水解后支化"的顺序机制得到先前研究的支持（Li等，2019）。因此，选择该双酶体系旨在非糊化体系中最大化支化效率同时保持颗粒完整性。

为解决非糊化体系中制备高支链淀粉时酶可及性和改性效率低的问题，本研究考察了CGTase和GBE双酶协同改性对三种不同结晶型淀粉（A型CS、B型马铃薯淀粉（PS）和C型豌豆淀粉（PBS））的影响。此外，我们提出C/G酶添加顺序将表现出最高的支化效率，特别是对于结晶结构较疏松的A型CS。比较了三种酶添加顺序：G/C（先GBE后CGTase）、C/G（先CGTase后GBE）和C + G（CGTase和GBE同时添加）。对分子晶体结构、比表面积、孔径分布和酶作用位点进行表征，以阐明酶添加顺序对不同结晶型淀粉支化效率和功能特性的影响。

材料

大肠杆菌BL21（DE3）（可异源表达GBE）购自北京百恩生物技术有限公司；CS（A型）、PS（B型）和PBS（C型）购自上海格恩生物科技有限公司；氯化钠（NaCl）、琼脂粉、酵母浸粉、蛋白胨、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、咪唑、盐酸、乙酸、醋酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠（NaOH）、二甲基亚砜（DMSO）、碘（I2）等。

颗粒形态分析

图1展示了三种不同结晶型淀粉在60°C下不同酶添加顺序改性前后的颗粒形态变化（SEM，3000倍放大观察）。相关研究表明，CGTase具有淀粉水解活性，能够催化淀粉长直链片段的水解，从而为GBE提供额外的底物（Lim等，2021）。如图1所示（图1A-E和I），改性后淀粉颗粒表面……

结论

本研究系统地考察了CGTase和Ph GBE双酶协同改性对非糊化体系中不同结晶型淀粉（A型CS、B型PS和C型PBS）的影响。结果表明，C/G顺序处理（先CGTase后GBE）显著提高了淀粉的支化度（α-1,6糖苷键比例高达15.14%），改善了短链（DP < 13）比例，有效降低了粘度、体外消化率……

CRediT作者贡献声明

龙杰：写作—审阅与编辑，方法学，资金获取，数据管理，概念化。王雅：写作—初稿，调查研究，数据管理。廖海超：调查研究，数据管理。李兴飞：写作—审阅与编辑，监督。李明举：写作—审阅与编辑。周星：写作—审阅与编辑。金郑宇：监督，资源，概念化。

利益冲突声明

无利益冲突需要声明。

致谢

本研究得到国家重点研发计划（2025YFD2100102-6）资助。

龙杰|王雅|廖海超|李兴飞|李明举|周星|金郑宇

江南大学食品科学与技术国家重点实验室，无锡市蠡湖大道1800号，214122，中国