冷藏解冻对悬浮液和胡萝卜中大肠杆菌O157:H7引起的亚致死损伤机制

《Food Microbiology》：Mechanism of sublethal injury induced by refrigerated thawing on Escherichia coli O157:H7 in suspension and carrot

　　

摘要

大肠杆菌（Escherichia coli）O157:H7可以在亚致死损伤状态下于冷冻环境中存活，且其存活行为可能因解冻条件而异；因此，采用适当的解冻方法来确保食品安全至关重要。冷藏解冻虽被推荐为安全方法，但从亚致死损伤细胞的形成与恢复角度来看，仍可能带来微生物风险。为评估这些风险，将大肠杆菌 O157:H7在?20°C条件下冷冻24小时，随后在不同条件下解冻（细菌悬浮液：4°C 180分钟，25°C 60分钟，37°C 30分钟；胡萝卜：4°C 16小时，25°C 2小时，37°C 30分钟）。测定了亚致死损伤率与恢复率、细胞膜完整性、细胞膜电位、胞内物质泄漏以及活性氧水平，并进行了共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析。在4°C条件下解冻时，亚致死损伤率很高，细菌悬浮液和胡萝卜中分别为99.44±0.05%和86.24±6.37%。经CLSM确认，这种损伤与膜完整性增加、膜去极化、胞内物质泄漏及结构损伤相关。此外，亚致死损伤细胞在3小时内恢复；胡萝卜中的细胞活性在冷冻-解冻（FT）后即刻得到确认，甚至在微波加热后仍被确认，表明冷冻-解冻后与亚致死损伤细胞相关的风险可能在后续处理过程中持续存在。这些结果表明，冷藏解冻并不能确保微生物安全，并强调有必要重新评估解冻实践，同时考虑冷冻食品中的亚致死损伤。

引言

大肠杆菌 O157:H7是一种代表性的食源性病原体，属于革兰氏阴性细菌，可引起严重疾病，如出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征（HUS），每年感染全球约280万人（Kim等，2025b；Majowicz等，2014）。该菌可通过受污染的来源（如土壤和灌溉水）传播，并已在新鲜农产品中检测到（Lee & Oh，2025；Moon等，2023）。最近，美国疾病控制与预防中心（CDC）报告了一起与胡萝卜相关的志贺毒素大肠杆菌（STEC）暴发事件，共造成48例发病，其中包括20例住院、1例HUS和1例死亡（CDC，2024）。此次暴发凸显了确保胡萝卜微生物安全性的重要性。由于胡萝卜常作为即食产品（如去皮小胡萝卜或鲜切胡萝卜）食用，在清洗、去皮和切分后通常不再经过加热处理即可直接食用（FDA，2008）。因此，残留在胡萝卜上的大肠杆菌 O157:H7可能直接传播给消费者，构成重大公共卫生风险，因为其感染剂量低且能引起严重疾病（Van Giau等，2016）。这种担忧进一步加剧，因为大肠杆菌 O157:H7能在低温下存活，并在整个冷冻和解冻过程中保持活性，因此需要严格控制污染（Manios & Skandamis，2015；Zhang等，2021）。

冷冻是一种经济有效的食品保存技术，可在保持食品感官质量和营养质量的同时抑制微生物生长（Suo等，2014；Zhang等，2021）。随着饮食习惯的变化和配送技术的进步，全球冷冻食品市场稳步增长，预计到2027年将达到约4040亿美元（Sun等，2023）。与此同时，冷冻技术的应用正从肉类产品扩展到农产品；由于稳定性强且方便，冷冻蔬菜的重要性日益凸显（Connell等，2018）。然而，冷冻并不能消除微生物（Kim & Oh，2025）。相反，它通过冰晶形成、脱水作用以及溶质浓度增加使微生物遭受亚致死损伤（Zeng等，2024）。

亚致死损伤是由各种物理和化学应激引起的可逆性细胞损伤，包括细胞膜、蛋白质、RNA和DNA的损伤（Man等，2025）。亚致死损伤细胞可能表现出生长减慢，尽管仍然存活，但在选择性培养基上可能检测不到，这可能导致实际微生物风险被低估（Zhang等，2021）。这些细胞保留了致病潜力，并在适当的温度和营养条件下可以恢复（Shao等，2022）。这种恢复现象在即食胡萝卜中尤为值得关注，因为富含营养物质和水分食品基质可能促进亚致死损伤病原体的恢复及随后的增殖（Ikram等，2024；Shao等，2023）。此外，由于即食胡萝卜在食用前不再经过额外的致死灭活步骤，恢复后的大肠杆菌 O157:H7可能重新获得感染能力并传播给消费者，引发严重疾病（FDA，2008）。鉴于亚致死损伤细胞的恢复潜力和公共卫生风险，了解其在冷冻和解冻过程中的命运至关重要。冷冻可在大肠杆菌O157:H7中引起亚致死损伤，而随后受损细胞的存活、损伤程度及恢复情况则取决于解冻条件（Zhang等，2021）。因此，适当的解冻管理对食品安全至关重要。

美国农业部食品安全和检验局（USDA-FSIS）警告不要在室温或高温条件下解冻食品，并推荐冷藏解冻作为防止细菌生长的更安全解冻方法（USDA-FSIS，2013；USDA-FSIS，2024）。这是一种缓慢的解冻方法，被认为有利于保持食品质地和质量（Kim等，2025a）。然而，病原体在低温下仍可存活，且缓慢解冻的较长持续时间可能延长细胞暴露在加剧亚致死损伤条件下的时间（Zhang等，2021）。因此，冷藏解冻应被视为相对于室温或高温解冻而言较为安全的替代方法，但并非完全无风险的做法。尽管如此，与冷藏解冻相关的潜在微生物风险仍被低估，冷藏解冻引起亚致死损伤的机制也尚未得到充分阐明。

本研究从亚致死损伤的角度调查了冷藏解冻对大肠杆菌 O157:H7的影响。为此，与室温（25°C）和高温（37°C）解冻相比，定量评估了冷藏（4°C）解冻条件下亚致死损伤细胞与死亡细胞的比例。此外，为阐明这些损伤模式背后的机制，进行了细胞水平的膜完整性、膜电位、胞内物质泄漏和活性氧（ROS）水平分析。利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获得了可视化证据。本研究旨在提供关键的科学证据，以重新评估当前解冻实践相关的微生物风险，并为冷冻食品解冻建立更安全的管理指南。

章节摘要

菌株与培养

本研究使用的大肠杆菌 O157:H7 ATCC 43889（美国模式培养物保藏中心，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）取自?80°C保存于50%（v/v）甘油中的菌种库。菌株划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA；Oxoid，英国），并在37°C培养24小时。随后将单个菌落转移至新鲜胰蛋白胨大豆肉汤（TSB；Oxoid，英国），在37°C培养16小时。用新鲜TSB洗涤细菌培养物，并在4°C下以8,000×g离心15分钟，最终...

FT处理后悬浮液中死亡率与亚致死损伤率的评价

为评估FT后大肠杆菌 O157:H7的活性状态，测定了TSA和SMAC上的活菌计数（表1），随后计算了死亡率（dead ratio）和亚致死损伤率（sublethal injury ratio）（图1）。不同解冻条件下TSA上的活菌计数无显著差异，而SMAC上的活菌计数存在显著差异。在4°C、25°C和37°C解冻条件下，各条件的死亡率分别为5.90±0.33%、5.66±0.57%和6.17±0.48%。

讨论

在本研究中，大肠杆菌 O157:H7悬浮液的亚致死损伤率因解冻条件而异。特别是，4°C解冻条件下的亚致死损伤率高达99.44±0.05%，与25°C条件下观察到的水平相似，且明显高于37°C条件下观察到的水平（图1）。这些结果表明，被认为可维护食品质量并抑制细菌生长的安全解冻方法——冷藏解冻，实际上可能...

结论

本研究证明，解冻条件显著影响大肠杆菌 O157:H7的亚致死损伤模式。特别是，4°C冷藏解冻引起了最广泛的复杂损伤，包括细胞膜完整性改变、膜去极化及胞内物质泄漏。尽管冷藏解冻已被公认为安全解冻方法，但研究结果表明，从亚致死损伤角度来看，其潜在风险可能被忽视...

CRediT作者贡献声明

Se-Wook Oh：撰写–审稿与编辑，监督，项目管理。Unji Kim：撰写–审稿与编辑。Na-Yeon Kim：撰写–审稿与编辑，撰写–初稿，可视化，验证，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念化。

未引用参考文献

Centers for Disease Control and Prevention, 2024; March and Ratnam, 1986; U.S. Department of Agriculture–Food Safety and Inspection Service, 2013; U.S. Department of Agriculture–Food Safety and Inspection Service, 2024; Zhang et al., 2025.

生成式AI和AI辅助技术声明

在准备本研究期间，作者在写作过程中使用了ChatGPT以提高可读性和语言质量。使用该工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对最终发表承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能对本论文报告的工作产生影响。

致谢

本研究由韩国食品、农业和林业技术规划评估院（IPET）通过高附加值食品技术开发计划（或项目）资助，由韩国农业食品农村部（MAFRA）提供资金（RS-2024-00404614）。

Na-Yeon Kim | Unji Kim | Se-Wook Oh

国民大学食品营养系，韩国首尔136-702