关键区域柔韧性维持与整体骨架刚性化的协同进化提升了脂肪酶合成维生素E琥珀酸酯的性能

《Food Research International》：Synergistic evolution of key-region flexibility maintenance and global scaffold Rigidification enhances lipase performance for vitamin E succinate synthesis

　　- 关键区域柔性保持与全局支架刚性化耦合。- M4 的活性是野生型 BSLA 的 4.35 倍。- 在 52°C 下，M4 的半衰期是野生型 BSLA 的 94.52 倍。- M4@AOMR 在 21 小时内实现了 91.83% 的 VES 收率。## 引言生物催化已成为绿色化学和可持续制造的核心技术，因其高效性、高选择性和环境相容性而备受重视（Bornscheuer, Hauer, Jaeger, & Schwaneberg, 2019; Sheldon & Brady, 2019）。酶相关技术还支撑了生物活性成分的发现、生产和评价。例如，蛋白酶引导的红藻蛋白计算机辅助筛选鉴定出潜在的二肽基肽酶 IV（DPP-IV）抑制肽和血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽（Basri, Amin, & Ahmad, 2025）。超声辅助和酶辅助提取也已被用于从辣木（*Moringa oleifera*）中回收生物活性多糖（Mezhoudi et al., 2025）。除作为催化剂外，针对 α-淀粉酶和 α-葡萄糖苷酶的酶抑制实验也被应用于评估植物提取物对 α-淀粉酶和 α-葡萄糖苷酶的酶抑制活性，如对 *Prunus microcarpa* 的研究（Jabbar & Ismail, 2025）。这些研究共同体现了酶促加工和基于酶的功能评价在食品、营养保健品和药物研究中的更广泛重要性。在工业应用中，酶通常需要在较高温度下运行，以提高底物溶解度并加快反应速率（Pinzón-Martínez et al., 2010; Siddiqui, 2017）。然而，大多数酶的最佳温度通常在 30–45°C 范围内，其热稳定性差，限制了其满足工业需求的能力。尽管众多研究通过化学修饰或分子工程显著提高了酶的热稳定性，但催化活性往往难以同时改善，由此产生了众所周知的"活性-稳定性权衡"（Luo, Song, Cui, Han, & Zhou, 2023）。类似的优化冲突也已在 pH 适应性与催化活性之间得到确认，表明平衡酶的稳健性与催化功能的难度超出了热稳定性范畴（Hu et al., 2025）。因此，克服这一权衡需要在不消除催化所需构象运动的前提下，深入理解如何增强结构稳定性的机制。酶以动态构象集合的形式存在，跨多个时间尺度的运动促进了底物结合、活性位点重组、催化周转和产物释放（Henkler-Wildman et al., 2007）。特别是催化环和其他功能区域的动态性可以调控酶的活性、选择性和周转率（Corbella, Pinto, & Kamerlin, 2023）。因此，蛋白质功能取决于结构稳定性与构象柔韧性之间的适当平衡：稳定性不足会增加热变性敏感性，而过度刚性化可能会抑制催化所需的运动（Fields, 2001; Teilum, Olsen, & Kragelund, 2011）。从这个角度来看，有效的热稳定性工程应该在保持产性局部柔韧性的同时，限制蛋白质支架其他区域的去稳定化波动。在这一框架下，合理设计和半合理蛋白质工程提供了调节酶稳定性和构象动态性的有力方法（Bornscheuer et al., 2012; Sheldon & Pereira, 2017; H. Yang, Liu, Li, Chen, & Du, 2015）。最近的研究通过整合数据库挖掘与 AI 辅助蛋白质工程扩展了这一工具箱，例如鉴定出热稳定的过程性内切葡聚糖酶 DbCel5A 并随后对其改良的 K27G 变体进行工程化（Lv et al., 2026）。在用于改善热稳定性的结构原理中，针对高度柔性区域的定向刚性化常被用于限制过度的结构波动和蛋白质展开，从而减少活性损失（Nestl & Hauer, 2014; H. Yu, Ma, Li, & Dalby, 2022; H. R. Yu & Huang, 2014）。柔性区域刚性化可通过多种策略实现，包括引入盐桥（Cai, Xu, Lu, Lin, & Yao, 2022）、二硫键（Quang, Joo, Yoo, & Kim, 2012）、特定区域的氢键（Wu et al., 2023）和脯氨酸替换（H. R. Yu, Zhao, Guo, Gan, & Huang, 2015）。例如，Wu 等人对木聚糖酶 XynA 的 N 端柔性环进行组合突变，通过在关键柔性区域增强氢键和疏水相互作用获得了突变体 Mut1 和 Mut2。这些突变体在 80°C 和 90°C 下孵育 12 小时后保留了超过 85% 的残余活性（Wu et al., 2023）。类似地，Yang 等人筛选了转谷氨酰胺酶中的高度柔性区域，获得了突变体 FRAPD-TGm2A，将其在 60°C 下的 *t*_1/2 从 71.9 分钟提高到 132.28 分钟（P. H. Yang et al., 2023）。然而，不加区别地增强酶刚性可能导致酶活性显著丧失。例如，Go 等人采用结合 PSSM、FireProt、ddg_monomer 和 Rosetta 的联合计算设计策略获得了二萜糖基转移酶 UGT76G1 的突变体 76_5。尽管其 *T*_m 提高了 16.6°C，但催化活性下降了约 50%，且在 45°C 下未检测到催化活性，表明过度刚性化可能损害蛋白质功能（Go, Lee, Ahn, Park, & Woo, 2023）。为解决这一问题，Chong 等人提出了 HLoD 策略，通过调节 CALB 关键环区域与 α5/α10 之间的动态耦合来保护关键酶区域的动态构象。所得突变体 M1 在 60°C 下表现出比野生型 CALB 高 7.0 倍的酶活性（Chong et al., 2024）。尽管这些策略证明了限制过度柔韧性或保护特定功能区域动态性的重要性，但它们通常只关注酶动态景观的一个方面。同时保持催化所需的关键功能区域构象柔韧性并抑制更广泛蛋白质支架中去稳定化波动的合理框架仍有待充分探索。此外，这种空间分化的酶动态调控能否同时改善活性、热稳定性和有机溶剂耐受性，并对工业相关生物催化过程产生益处，尚未得到系统验证。因此，我们假设在保持与催化相关的局部柔韧性的同时刚性化全局蛋白质支架，可以同时改善酶的催化活性、热稳定性和有机溶剂耐受性。这一未解决的挑战对于维生素 E 琥珀酸酯（VES）的生物催化生产尤为重要，VES 是一种 α-生育酚酯，比游离维生素 E 具有更高的化学稳定性，在食品、营养补充剂和药物中具有广泛潜力（Ma et al., 2023）。传统 VES 合成需要高温和碱性或金属催化剂，这可能促进生育酚氧化、副产物形成和成本高昂的下游纯化。脂肪酶催化合成提供更温和的条件、更高的选择性和更简单的产物分离，使其成为一种有前景的绿色替代方案（Zou, Dai, Liu, & Du, 2021）。然而，其在工业中的应用仍受限于低催化效率、脂肪酶在有机溶剂中稳定性差和放大挑战（Li, Lin, Lan, & Wang, 2024）。因此，开发兼具高活性、热稳定性和有机溶剂耐受性的脂肪酶为评估所提出的酶动态空间分化调控提供了工业相关的背景。基于上述考虑，本研究旨在以枯草芽孢杆菌脂肪酶 A（BSLA）为模型酶，开发并验证一种合理设计框架。该框架整合了关键区域柔性保持（保留与催化相关的局部动态性）和全局支架刚性化（稳定更广泛的蛋白质框架）。B 因子和保守性分析、FireProt 和 FoldX 被整合用于鉴定预期能稳定全局蛋白质支架的突变。温度依赖性分子动力学（MD）模拟被用于定位与催化相关的柔性区域并指导保留其功能动态性的突变设计。随后将两个设计组件的突变相结合，以评估酶动态的空间分化调控能否同时改善催化活性、热稳定性和有机溶剂耐受性。最后，将最优变体固定化在氨基和十八烷基双官能多孔树脂（AOMR）上，并在 VES 合成中进行评估，从而将计算设计与实际生物催化应用联系起来。## 章节摘要### 化学品、菌株、质粒和培养介质将带有 C 端 6×His 标签的 BSLA 编码序列克隆到表达载体 pET-28a(+) 中，所得重组质粒被导入 *Escherichia coli* BL21(DE3) 中进行蛋白质表达。本研究使用的菌株、质粒和引物均购自安徽全普生物系统有限公司。Mut Express II Fast 定点突变试剂盒 V2 购自南京纳微生物技术股份有限公司。质粒纯化试剂盒、蛋白质分子量### 个体工程策略的实验验证与局限性为明确单一工程策略能否同时改善 BSLA 的热稳定性并保持催化活性，本研究分别对关键区域柔性保持策略和全局支架刚性化策略进行了实验验证，并比较了两种策略在 BSLA 工程化中的优势和局限性。首先，对关键区域柔性保持策略进行了实验验证。对 RMSF 曲线进行分析### 结论本研究开发并验证了一种将关键区域柔性保持与全局支架刚性化相结合的合理设计策略，以提高 BSLA 的活性和稳定性。在 55°C 下孵育 10 分钟后，最优变体 M4 的处理后残余活性是野生型的 21.37 倍。其初始催化活性也是野生型的 4.35 倍。在 52°C 下，半衰期从野生型的 3.78 分钟增加到 M4 的 357.30 分钟，即半衰期提高了 94.52### CRediT 作者贡献声明**张瑜**：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，方法学，调查研究，形式分析，数据管理。**郑兵谦**：撰写——审稿与编辑，可视化。**杜家祥**：软件，调查研究。**陈志恒**：软件。**张子涵**：方法学。**刘青青**：调查研究。**范育台**：调查研究。**高震**：撰写——审稿与编辑，资金获取。**郑伟义**：撰写——审稿与编辑。**胡怡**：撰写——审稿与编辑，### 利益冲突声明作者声明他们不存在已知的相互竞争的经济利益或个人关系，这些关系可能被认为影响本研究中报告的工作。### 致谢本研究由以下项目资助：国家自然科学基金（编号 32402026）、江苏省重大创新平台计划（BM20250017）、材料导向化学工程国家重点实验室（SKL-MCE-25A15）、江苏省教育厅自然科学研究项目（24KJB530015）、微生物技术国家重点实验室开放课题基金（项目编号 M2025-22）、基础研究项目---张瑜 | 郑兵谦 | 杜家祥 | 陈志恒 | 张子涵 | 刘青青 | 范育台 | 高震 | 郑伟义 | 胡怡 | 年彬彬