植物相关细菌柱花草布鲁氏菌和羽扇豆布鲁氏菌的脂多糖脂质A结构及其生物合成基因的比较分析

《International Journal of Biological Macromolecules》：Comparative analysis of lipopolysaccharide lipid A structure and its biosynthetic genes in the plant-associated bacteria Brucella cytisi and Brucella lupini

　　

• B. cytisi和B. lupini的脂质A结构几乎完全相同。
• 脂质A分子含有GlcpN3N二糖骨架。
• 初级3-OH脂肪酸以酰胺键连接在脂质A上。
• 次级酰基链包括19:0cyc和28:0(27-OH)。
• B. cytisi和B. lupini共享几乎相同的脂质A基因座。

引言
布鲁氏菌属是一类革兰氏阴性α-变形菌，属于布鲁氏菌科[1]。该属包含若干重要的人/动物病原体，如B. anthropi、B. abortus、B. suis、B. ovis和B. melitensis，以及环境共生物种，包括根际和内生相关细菌（B. oryzae、B. rhizosphaerae）和植物共生菌（B. cytisi、B. lupini）。值得注意的是，这些物种中的一些此前曾被归类于Ochrobactrum属，例如B. anthropi以前被称为Ochrobactrum anthropi。2020年，H?rdt等人[2]基于高度平均核苷酸一致性（ANI）值，提议将Ochrobactrum物种重新归类至布鲁氏菌属，从而建立了更广泛的布鲁氏菌/Ochrobactrum属。然而，尽管基因组相似性很高，经典布鲁氏菌病原体与前Ochrobactrum物种之间仍存在显著的表型和生态差异。这些差异已使一些研究者质疑将它们归入同一属的适当性[3]。

Brucella cytisi ESC1T和Brucella lupini LUP21T此前被归入Ochrobactrum属，是豆科植物的速生长内共生菌。B. cytisi ESC1T最初从西班牙土壤中生长的Cytisus scoparius根瘤中分离获得，同时也是Medicago sativa（紫花苜蓿）的微小共生体。该菌株已显示出对重金属（包括Cu2+、Zn2+和Cd2+离子）的显著生物吸附能力[4]。相比之下，从Lupinus honoratus根瘤中分离获得的B. lupini LUP21T能够与其他Lupinus物种形成有效的固氮共生关系[5]。系统发育分析表明，这两个菌株均与机会性人类病原体Brucella anthropi密切相关[4]。作为革兰氏阴性细菌，这些菌株产生脂多糖（LPS），这是一种嵌入外膜中的复杂两亲性分子。LPS分子由三个不同的结构区域组成：脂质A、核心寡糖和O-多糖，每个区域都具有独特的化学结构和生物学功能[6]。在致病性布鲁氏菌中，LPS被认为是关键毒力因子。值得注意的是，这些细菌的LPS表现出异常低的内毒素活性，从而限制了宿主天然免疫受体对其的识别。这一特征有助于免疫逃逸，并有助于病原体建立慢性感染的能力[7]、[8]、[9]。相比之下，在共生性布鲁氏菌中，LPS的适当结构对于维持类菌体（根瘤中固氮状态的根瘤菌形态）的形态和功能是必需的。LPS还通过延迟或抑制早期共生感染阶段的过敏反应（HR）和系统性获得性抗性（SAR）来调节植物防御反应[10]。

脂质A构成革兰氏阴性细菌外膜外叶的主要部分，并主要负责致病细菌LPS的内毒素活性[6]。过去，脂质A在共生细菌的背景下被认为在功能上无关紧要。然而，已发表的数据表明，根瘤菌脂质A中存在超长链（ω-1）羟基脂肪酸（VLCFAs，含有26至33个碳原子），这对维持外膜的结构和物理化学性质起着关键作用，这对于有效共生的建立至关重要[11]。涉及脂质A生物合成基因的破坏已被证明会损害膜稳定性，导致对环境应激因素（如pH波动和渗透压）的敏感性增加。这些突变体还表现出生长速率降低、根瘤形成延迟和固氮能力显著下降，凸显了脂质A结构在共生效率中的重要性[12]。最近的研究进一步强调了VLCFAs的生物学意义，证明其缺失显著影响细菌适应度。在植物致病性Agrobacterium fabrum中，脂质A中27-羟基二十八烷酸（C28:0(27-OH)）的缺失导致对环境应激的抗性降低、生物膜形成和运动性受损以及植物感染力下降，表明VLCFAs不仅有助于膜结构，还有助于宿主定殖和适应过程[13]。

根瘤菌的脂质A分子表现出相当大的结构多样性。Rhizobium属和Sinorhizobium属成员的脂质A含有由氨基葡萄糖和2-氨基葡萄糖酸组成的骨架[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]，而大多数其他形成根瘤的细菌其二糖骨架仅由2,3-二氨基-2,3-脱氧-D-葡萄糖（GlcpN3N）组成[20]、[21]、[22]、[23]。这些糖骨架以酰胺键和酯键连接的3-羟基脂肪酸进行取代，其羟基可进一步被非极性脂肪酸以及（ω-1）羟基取代或氧代取代的超长链脂肪酸酰化[12]。其中，C28:0(27-OH)是α-根瘤菌脂质A中最常见的VLCFA（Azorhizobium属除外），被认为是该细菌群的化学分类标志[24]、[25]。在某些慢生根瘤菌物种中，VLCFAs可进一步被3-羟基丁酸、3-甲氧基丁酸或一两个藿烷醇残基取代，进一步增加了脂质A的结构复杂性[12]、[23]、[26]。

尽管文献中关于布鲁氏菌形态学和遗传学的报道众多，但关于该属代表菌株脂质A结构的了解仍然有限。已知机会性B. anthropi和致病性B. suis的脂质A含有二氨基葡萄糖骨架。相比之下，致病性B. abortus可能具有两种类型的脂质A骨架。主要的脂质A骨架由两个GlcN3N残基组成。然而，据报道存在结构异质性，即β-(1→6)-连接的二糖中一个GlcN3N单位可被氨基葡萄糖取代，从而产生混合的GlcN3N-GlcN脂质A骨架。这两种类型的脂质A可能影响布鲁氏菌对不同宿主环境的适应以及其免疫逃逸能力[8]、[27]、[28]。B. abortus的脂质A主要为五酰化和六酰化。它含有初级3-羟基脂肪酸（包括C16:0(3-OH)和C18:0(3-OH)）。某些形式可能还含有C20:0(3-OH)，以及次级非羟基化脂肪酸（如C12:0、C16:0、C18:0）和VLCFAs（如C28:0(27-OH)）。这些VLCFAs连接到位于远端GlcN3N的C3'位上的3-羟基酸[9]、[27]、[28]、[29]。基于MALDI MS和LID MS/MS获得的數據表明，B. abortus和B. suis的脂质A主要为六酰化和五酰化，并在C-1位（还原性GlcpN3N）被焦磷酸乙醇胺取代，在非还原性GlcpN3N的C-4'位被磷酸残基取代[27]。致病性布鲁氏菌中脂质A的结构变异可能通过调节天然免疫识别来影响宿主-病原体相互作用，同时保留该属特有的隐蔽特性[8]、[27]。

植物相关布鲁氏菌物种的脂质A结构此前未被描述过。尽管已在多种致病性和机会性布鲁氏菌中研究了脂质A，但这些研究主要关注其对毒力、免疫逃逸和宿主天然免疫反应调节的贡献，而非建立其完整的分子结构。相比之下，本研究提供了Brucella cytisi ESC1T和Brucella lupini LUP21T脂质A的全面结构表征，包括基于GC–MS、质谱和核磁共振波谱法确定碳水化合物骨架和分子内各脂肪酸的分布。此外，还进行了编码脂质A生物合成和结构修饰中参与酶的基因的 comparative 分析，为观察到的结构特征提供了遗传背景。结构与基因组分析的整合提供了一个全面的框架，用于阐明脂质A的分子结构及其生物合成和结构多样性的遗传决定因素。

章节片段
细菌培养条件
B. cytisi ESC1T（已知为Ochrobactrum cytisi：CECT: 7172、BCCM/LMG: 22713、DSM: 19778）和B. lupini LUP21T（已知为Ochrobactrum lupini：BCCM/LMG: 22726、NBRC: 102587）菌株由E. Velazquez教授（西班牙萨拉曼卡大学）惠赠。这些细菌是最早分离的属于Ochrobactrum属的豆科植物微小共生体之一。细菌在28°C下于79CA液体培养基中培养6天，以120 rpm剧烈振荡通气，包括

B. cytisi ESC1T和B. lupini LUP21T脂质A结构的分析
脱脂处理的B. cytisi和B. lupini细胞用热水中的热酚酚提取（材料与方法，第2.2节），LPS主要存在于酚相中。脂质A组分通过LPS的温和酸水解释放。在两种细菌中，脂质A中检测到的唯一糖组分均为GlcpN3N。其绝对构型为D型（数据未显示）。脂肪酸分析显示存在三组：3-羟基酸、中性酸和羟基化长链

讨论
在本研究中，我们描述了Brucella cytisi ESC1T和Brucella lupini LUP21T的脂质A结构。尽管此前已描述了致病性和机会性布鲁氏菌的脂质A结构，但植物相关布鲁氏菌的相应结构数据尚未可获得。本研究首次提供了植物相关布鲁氏菌物种脂质A的结构表征，并可与致病性布鲁氏菌和植物相关成员进行比较

CRediT作者贡献声明
Katarzyna Zam?yńska：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、项目管理、方法学、调查、资金获取、形式分析、数据整理、概念构思。Kamil ?ebracki：撰写——初稿、可视化、验证、软件、方法学、调查、形式分析、数据整理、概念构思。Ma?gorzata Pac-Sosińska：资源、调查。Zbigniew Kaczyński：调查、形式分析、数据

资金
本研究作为波兰卢布林玛丽亚·居里·斯克沃多夫斯卡大学生物科学研究所资助项目的一部分开展（编号：MN/2023/1）。

利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本论文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

Katarzyna Zam?yńska | Kamil ?ebracki | Ma?gorzata Pac-Sosińska | Zbigniew Kaczyński | Iwona Komaniecka | Adam Choma