《International Journal of Biological Macromolecules》：Biologically-synthesized zinc oxide nanoparticle-based α-synuclein nanoformulation mitigates Parkinson's disease progression in
Drosophila melanogaster
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摘要帕金森病（PD）是一种突触核蛋白病，其特征是α-突触核蛋白（αS）淀粉样聚集体的积累和多巴胺能神经元的丢失。有证据表明，PD起源于肠道，并通过迷走神经逐渐发展到大脑。因此，首先探讨了口服给予的αS预制纤维（PFF）在野生型黑腹果蝇（Drosophila melanogaste
摘要
帕金森病（PD）是一种突触核蛋白病，其特征是α-突触核蛋白（αS）淀粉样聚集体的积累和多巴胺能神经元的丢失。有证据表明，PD起源于肠道，并通过迷走神经逐渐发展到大脑。因此，首先探讨了口服给予的αS预制纤维（PFF）在野生型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中诱导PD的可能性，结果支持了感染从肠道向大脑逆向传播的假设，并表现出类似PD的症状，包括运动和非运动症状以及多巴胺能神经元的退化。然而，当将这些PD果蝇转移到含有绿色合成的氧化锌纳米粒子表面吸附的αS纳米制剂（NF）的饲料中时，由于恢复了能够清除累积的病理PFF的自噬复合体表达，并减轻了氧化应激和炎症，PD症状得到了缓解。总体而言，这些发现表明NF具有对抗进展性PD的治疗潜力。
引言
帕金森病（PD）主要是一种突触核蛋白病，其特征是运动功能障碍，包括静止性震颤、动作迟缓和姿势不稳，以及一系列非运动症状[1], [2]。在细胞水平上，PD表现为黑质中多巴胺能神经元（DA）的逐渐丢失，随后出现主要由不可溶的α-突触核蛋白（αS）淀粉样聚合体组成的路易小体[3], [4]。PD的确切病因仍不清楚，因为该疾病通常在晚期才被诊断出来，这使得识别导致发病的因素变得困难。然而，越来越多的证据表明，PD的发病始于胃肠道（GI） tract，在通过迷走神经逆向传播到大脑之前[5], [6], [7]，这也会引起非运动症状，如胃肠道功能障碍[8]。据报道，αS淀粉样聚集体可能作为模板，招募神经元中的可溶性单体αS（αSm），从而引发类似朊病毒的感染[9]。此外，这些聚集体还会触发炎症信号通路，伴随着细胞内运输受阻、蛋白质清除机制缺陷、氧化应激和蛋白质稳态紊乱[10], [11]。在PD中起关键作用的一个因素是retromer复合体，这是一种参与内体分选和内体到高尔基体运输的保守蛋白复合体；retromer介导的囊泡运输障碍在许多神经退行性疾病中很常见[12]。实际上，retromer复合体的一个亚基VPS35的突变会导致常染色体显性形式的PD[13], [14]。在啮齿动物模型中，DA神经元中VPS35的杂合子缺失会通过抑制自噬导致αS聚体的积累，最终导致神经元死亡[15], [16]。自噬负责清除细胞内的蛋白质聚集体，如tau和αS聚集体[17], [18]。自噬机制对囊泡运输障碍极为敏感，因为retromer复合体影响对溶酶体功能至关重要的酶和膜蛋白的运输；因此，恢复这个受损复合体的功能可能是逆转进展性PD的可持续方法[19]。
自噬抵抗性淀粉样聚集体的积累还会产生氧化应激，激活小胶质细胞和星形胶质细胞释放促炎细胞因子，从而引发神经炎症[20]。这些炎症反应进一步破坏正常的囊泡运输并阻碍自噬介导的清除过程，从而在疾病初期就开始了一个恶性循环[21]。在这里，不同的基于植物化合物的保护方法因其抗淀粉样聚集和抗氧化特性而被体外用于缓解PD。尽管体外结果令人满意，但它们在PD管理中的使用存在一些缺点，例如吸收和生物利用度较低，包括难以穿透血脑屏障（BBB）。然而，植物化合物吸附的金属纳米颗粒可以通过“Depot效应”持续释放这些化合物，从而提高其生物利用度和疗效，且剂量相对较低[22]。有趣的是，主要由植物化合物组成的绿色合成的氧化锌纳米颗粒能够有效地隔离αS单体，使其通过熵驱动聚集形成非细胞毒性的无定形聚集体，称为floc[23]。由于其大小、成分和多孔性质，人们认为这种floc能够有效地将表面吸附的生物活性分子（包括蛋白质）输送到宿主体内，有望恢复受损的retromer复合体并减轻氧化应激，从而逆转PD的进展。
因此，这项工作探索了floc在野生型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中对PD的治疗潜力。这种生物具有较短的生命周期、高度的遗传可操作性，以及约75%与人类疾病途径的相似性，使其成为研究PD机制和早期发现的理想模型[24]。此外，较短的寿命允许随时间持续监测疾病进展，使其更适合研究进展性PD[25]。我们发现，在PFF补充饲料中饲养的野生型果蝇会出现严重的运动和非运动症状，并伴随DA神经元的丢失，这是进展性PD的特点。我们还发现，这种饲料会影响参与囊泡运输的基因表达，从而阻碍自噬介导的聚集体清除，导致野生型果蝇的PD进展。当将这些PD果蝇转移到含有绿色合成的氧化锌纳米粒子表面吸附的αS纳米制剂（NF）的饲料中时，retromer复合体的表达得到恢复，相应的自噬和抗炎标志物的表达也随之增加。体外和体内结果显著表明，表面吸附的生物活性单体蛋白质和植物化合物协同作用可以逆转PD的进展，从而突出了NF在帕金森病中的治疗潜力。
章节片段
果蝇饲养和品系
Oregon R果蝇来自印度C-CAMP Bangalore，在所有实验中均使用。所有果蝇品系均在25°C和60%湿度下，按照12/12小时的明暗周期，在标准玉米粉-酵母蔗糖饲料中饲养。在果蝇饲料中添加了Nipagin（Himedia, India）和丙酸（Himedia, India）以防止微生物污染。
αS的表达和纯化
按照已发表的方案[26]表达和纯化了重组人αS。纯化后的蛋白质被冻干并储存在?20°C以备后续使用
口服给药的PFF在野生型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中表现出运动和非运动功能障碍
已有报告指出αS淀粉样聚集体参与了神经退行性表型的形成，支持了它们在PD发病和进展中的作用[6], [34]。然而，目前尚不清楚口服给药的PFF如何在野生型D. melanogaster中诱导PD病理。为了研究这一点，我们将果蝇分组（WT），分别给予不同剂量的PFF（即每组果蝇60、250和500μg PFF），并在30天内评估行为和表型的变化
讨论
大约90%的PD患者是特发性的[56]。多种遗传和环境因素被认为会导致αS聚合为淀粉样纤维，从而触发疾病的发病机制[57]。其中，外源性的病理αS淀粉样纤维已经显示出通过迷走神经的朊病毒样传播，经由肠道连接至大脑[6], [34]。因此，我们通过口服给予病理αS纤维（PFF）来在野生型果蝇中建立PD病理
CRediT作者贡献声明
Sonali Jena：撰写原创草案、验证、方法学设计、数据分析。Kumari Subham：数据分析。Harshit Kalra：数据分析。Seekha Naik：数据分析。Dibyam Debasish Sahu：数据分析。Monalisa Mishra：监督、数据分析。Suman Jha：撰写-审稿与编辑、可视化处理、项目管理、资金获取、数据分析、概念构思。
材料可用性
利益冲突声明
印度医学研究委员会的财政支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报道的工作。
致谢
Suman Jha感谢印度医学研究委员会（35/05/2020-Nano/BMS）的财政支持。Jha博士还感谢印度N.I.T. Rourkela的中央研究设施提供的ICTC、D.S.C.、圆二色性和共聚焦显微镜设施。此外，Sonali Jena感谢印度科学和工业研究委员会（CSIR）提供的奖学金。作者们还感谢BioRender软件在实验准备中的帮助
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