《International Journal of Biological Macromolecules》：SH3-like domains from
Leuconostoc citreum ABK-1 alternansucrase enables efficient enzyme immobilization
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摘要酶固定化技术通常用于提高酶的稳定性与可重复使用性，以服务于工业应用。本研究开发了一种基于柠檬乳杆菌（Leuconostoc citreum）ABK-1 交替蔗糖酶（LcAlts）SH3样结构域的新型非共价固定化策略。SH3样结构域具有疏水表面，提示其具备与疏水材料相互作用
摘要
酶固定化技术通常用于提高酶的稳定性与可重复使用性，以服务于工业应用。本研究开发了一种基于柠檬乳杆菌（Leuconostoc citreum）ABK-1 交替蔗糖酶（LcAlts）SH3样结构域的新型非共价固定化策略。SH3样结构域具有疏水表面，提示其具备与疏水材料相互作用的能力。基于此特性，无需添加抗去溶剂盐，LcAlts 即可通过疏水相互作用成功固定化于苯基琼脂糖?（Phenyl Sepharose?）微珠上。在最佳条件下（pH 5–7 且 ≤30 °C），固定化酶表现出强结合稳定性。此外，固定化拓宽了酶的操作 pH 范围，并增强了其在酸性和热条件下的稳定性，尽管催化效率略有降低。重要的是，固定化酶保持了与游离酶相似的葡糖寡糖（GOS）产物谱。此外，SH3样结构域还成功应用于异源蛋白的固定化，证明其作为亲和标签的通用性。本研究提供了一种简单有效的固定化策略，在提升酶稳健性的同时，支持固定载体的便捷回收与重复使用，有助于实现更可持续、更具成本效益的生物催化过程。
引言
酶固定化是一种广泛用于增强酶稳定性与可重复使用性的技术 [1], [2]。固定化酶的使用可降低生产和纯化成本，从而使其在工业应用中更具经济可行性。酶可通过多种技术固定化于载体或酶自身，每种技术各有其优缺点。
通过多个共价键将酶固定化于载体上相较于其他固定化方法具有优势，因为酶与载体之间的相互作用较强，从而减少了反应过程中酶的泄漏 [3]。然而，共价键的形成可能改变酶的空间构象，从而降低其催化活性。此外，与酶共价结合的载体往往难以重复使用，这可能增加整体工艺成本。相比之下，通过非共价相互作用进行固定化允许载体材料的循环利用。非共价固定化可能依赖于酶与载体之间的非特异性相互作用，如范德华力、离子相互作用和氢键。在此类体系中，酶分子可能在载体上随机取向，这可能阻碍活性位点并降低酶活性。
另一种方法是通过对酶进行工程化改造，将特异性肽段或结构域引入酶中，以提高酶在载体上的结合特异性与取向，例如结合 Ni-NTA 的组氨酸标签 [4]、与几丁质基材料相互作用的几丁质结合结构域 [5]，以及生物素-亲和素系统 [6]。然而，采用这些方法固定化的酶在环境条件变化时可能从载体上脱落，且通常需要具有特定功能基团的载体材料，其成本相对较高。因此，亟需开发新型非共价固定化策略以提高稳定性，以克服当前固定化技术的局限性。
将酶与能够特异性结合特定材料的结构域融合，有助于实现亲和酶固定化。多种结构域已被应用于酶固定化，如几丁质结合结构域 [7]、麦芽糖结合结构域 [8] 和葡聚糖结合结构域 [9]。通过此类结构域的相互作用进行固定化具有高度特异性，即使在条件变化时也易于脱附。然而，该技术需要含有特定功能基团和生物结构的材料，而这些材料可能无法广泛商业化获得。
交替蔗糖酶是一种属于糖苷水解酶家族 70（GH70）的葡萄糖基转移酶 [10]。它催化蔗糖上的葡萄糖基转移至受体，合成主要为交替排列的 α-1,3 和 α-1,6 键连接的葡聚糖（即"交替葡聚糖"），以及葡糖寡糖（GOS）。交替蔗糖酶产生的交替葡聚糖和 GOS 在医学、营养保健品和制药领域具有广泛应用潜力，因其具有益生元 [11] 和免疫刺激 [12] 等有趣生物学活性。既往研究报道了利用固定化于戊二醛活化壳聚糖上的交替蔗糖酶生产寡糖 [13]。然而，关于交替蔗糖酶的其他固定化策略仍有待深入探索。
既往研究表明，柠檬乳杆菌（Leuconostoc citreum）ABK-1 交替蔗糖酶（LcAlts）由多个关键结构域组成，包括催化结构域、葡聚糖结合结构域和 SH3 样结构域 [14]。一般而言，SH3 结构域长度约为 60 个氨基酸，具有 β 桶状折叠结构 [15]。SH3 结构域的折叠形成疏水口袋，在与其他蛋白或脂质结合中发挥重要作用 [16], [17], [18]。SH3 结构域常见于多种真核蛋白，参与细胞骨架组织和细胞信号传导 [19]。然而，SH3 结构域在细菌蛋白中的功能仍不明确。对于 LcAlts，SH3 样结构域以七重复形式存在于多肽链的 C 末端。这些结构域是交替蔗糖酶中不常见的附加结构域。删除 SH3 样结构域会影响酶动力学并改变交替葡聚糖纳米颗粒产物粒径 [14]。鉴于 SH3 样结构域与多种生物分子疏水表面相互作用的能力，这一特性对于将 LcAlts 固定化于疏水材料尤为值得关注。
在本研究中，LcAlts 被固定化于苯基琼脂糖?微珠上。系统研究了环境条件对蛋白脱附的影响。评估了固定化酶的生化性质和 GOS 合成能力，并与游离酶进行比较。此外，将 LcAlts 的 SH3 样结构域与红色荧光蛋白（RFP）融合，以探索利用该结构域将其他酶固定化于苯基琼脂糖?树脂的可行性。本研究的结果不仅展示了一种新型固定化策略，还证明了一种稳定可持续的方法，因为载体材料易于回收和重复使用。
章节片段
LcAlts 的表达
LcAlts 采用此前描述的方法在 E. coli BL21 (DE3) 中表达 [14]。简言之，含有重组质粒的菌体在含 0.1 mg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中，于 37 °C、200 rpm 振荡培养。当 OD600 达到 0.6 时，加入 IPTG 至终浓度为 0.4 mM。随后在 16 °C、200 rpm 振荡过夜培养。通过离心收集菌体并悬浮于 25 mM 磷酸钾缓冲液（pH 6.0）中。细胞随后
LcAlts 在苯基琼脂糖?微珠上的固定化
LcAlts 在其 C 末端含有七重复的 SH3 样结构域。氨基酸残基极性分析显示，SH3 样结构域的极性低于催化结构域和葡聚糖结合结构域（GBDs）（图 1A）。基于文献 [22] 的标度计算，SH3 样结构域的平均极性得分为 9.124，而催化结构域和 GBD 的分别为 12.162（图 1B）。这些结果表明，SH3 样结构域可能更倾向于与
结论
本研究证明，LcAlts 的 SH3 样结构域可用作将酶固定化于疏水载体上的功能模块。固定化酶表现出改善的 pH 耐受性和热稳定性，同时保持了其产生 GOS 的能力。RFP-SH3 融合蛋白的成功固定化进一步表明，SH3 样结构域作为通用固定化标签具有通用性。重要的是，这种非共价策略允许
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本研究使用了生成式 AI 来提升本稿件的可读性并润色语言。在初步润色后，所有作者对最终版本进行了批判性审阅和修订，以确保内容与原始意图、实验证据和实验结果保持一致。所有作者对本作品的准确性和完整性承担全部责任。
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本项目由朱拉隆功大学 Ratchadaphiseksomphot 基金 [RCU_69_012_2300_002]（资助 KW）资助。我们同时感谢朱拉隆功大学理学院生物化学系 Kittikhun Wangkanont 副教授在关键化学品方面提供的支持。
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