《International Journal of Biological Macromolecules》：Evolutionary characterization and structure-guided discovery of the β-barrel assembly machinery in
Treponema pallidum subsp.
pallidum reveals a putative BamD-like protein
编辑推荐：
•Tp0625是T. pallidum中一种先前未被识别的BamD样蛋白。•尽管Tp0625与BamD的序列一致性很低，但仍采用保守的TPR折叠结构。•Tp0625直接结合BamA的含POTRA5区域。•静电相互作用稳定Tp0625-BamA复合物。•结构导向筛选识别出螺旋体
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Tp0625是T. pallidum中一种先前未被识别的BamD样蛋白。
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尽管Tp0625与BamD的序列一致性很低，但仍采用保守的TPR折叠结构。
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Tp0625直接结合BamA的含POTRA5区域。
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静电相互作用稳定Tp0625-BamA复合物。
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结构导向筛选识别出螺旋体中分歧性蛋白同源物。
引言
梅毒是一种由Treponema pallidum亚种pallidum引起的慢性、系统性性传播感染，持续对全球公共卫生构成重大威胁[1]。尽管青霉素在20世纪的大规模使用使梅毒得到了有效控制，但自21世纪初以来，其发病率在全球范围内再次上升[2]。2022年，世界卫生组织（WHO）报告全球成人梅毒新发感染约800万例[3]。作为一种具有极端宿主依赖性的专性寄生细菌，T. pallidum拥有高度缩减的基因组和有限的生物合成能力，使其体外培养和遗传操作极为困难，从而长期阻碍了对其致病分子机制的研究[4]。
然而，T. pallidum能够在宿主体内建立持续性感染并维持高度毒力，这一特性与其独特的膜解剖结构有关[5]。尽管T. pallidum具有典型的革兰氏阴性菌双层膜结构，但其外膜蛋白（OMP）分布却极为稀疏[6]，然而这些OMP在营养摄取、黏附、侵袭和外膜完整性方面发挥着至关重要的作用[7]。
在革兰氏阴性菌中，OMP的组装和外膜插入主要依赖于β桶组装机器（BAM）复合物[8]。在细胞质中合成的OMP前体通过SecYEG复合体转运至周质空间，随后由分子伴侣SurA递送至BAM系统进行组装；然而，错误折叠的蛋白则由分子伴侣Skp引导至DegP进行降解，从而确保质量控制[8]，[9]。因此，BAM复合物及其分子伴侣在介导OMP生物合成和维持外膜稳态中处于核心地位[8]。
T. pallidum的外膜缺乏经典OMP的直接同源物，仅鉴定出BAM核心组分BamA的同源物（也称为Tp0326或Tp92）[7]。尽管BAM复合物的功能在进化上保守，但其亚基组成在不同细菌物种间存在差异[10]。以Escherichia coli为例，该复合物由Omp85家族蛋白BamA和四种辅助蛋白（BamB-E）组成。BamA的多肽转运相关（POTRA）结构域是介导亚基间相互作用的关键位点，与BamB和BamD直接相互作用，而BamC和BamE与BamD形成蛋白亚复合物，通过BamD与BamA结合[8]，[11]。早期利用凝胶过滤色谱（SEC）分析的研究表明，T. pallidum裂解液中的BAM复合物分子量约为300–400 kDa，显著大于对应的E. coli复合物[12]。此外，近年来发现的TAM复合物（由TamA和TamB组成）也参与某些特定OMP的组装，如TolC外排泵和FimD组装蛋白[13]。值得注意的是，螺旋体通常缺乏TamA的直接同源物；然而，在Borrelia burgdorferi中，TamB被发现与BamA直接相互作用，且已鉴定出BamB和BamD的同源物[14]。此外，B. burgdorferi中BamB和BamD的同源物明显短于其他细菌中的同源蛋白，提示螺旋体可能具有独特的蛋白折叠和组装系统[15]。基于此，推测T. pallidum的BAM复合物可能由Tp0326、BamB、BamD、TamB同源物或其他独特组分组成。
鉴于T. pallidum中同源蛋白间序列相似性极低，传统的序列比对方法（如BLAST）无法识别其BAM系统组分。然而，即使序列一致性低于10%，蛋白结构往往仍然高度保守[16]。随着AlphaFold 3等深度学习算法的进步[17]，[18]，[19]，本研究首先利用系统发育分析探讨TreponemaOmp85家族蛋白的进化保守性；采用结构相似性策略，结合原位免疫沉淀-质谱（IP-MS）实验，系统筛选并鉴定了T. pallidumBAM复合物的关键组分及其分子伴侣，旨在阐明其OMP组装的分子基础（图1）。
各节摘要
系统发育树的构建和转录单位分析
从NCBI获取已测序的Treponema和Borrelia物种蛋白质组数据，利用HMMER（v3.4）结合Pfam模型（PF01103）筛选Omp85超家族结构域。根据结构域比对结果提取相应的β桶序列，并结合预测结构信息进行手动校正。对提取的β桶序列进行去重，相似度阈值为95%。使用MAFFT（v7.505）构建多序列比对[20]
T. pallidum中BAM和TAM系统的进化特征
为研究T. pallidum中OMP组装系统的进化，从代表性的Treponema和Borrelia物种中鉴定Omp85家族蛋白。所有分析的物种均编码Omp85家族的核心保守成员，即BamA同源物，经InterProScan鉴定含有五个POTRA结构域。Omp85 β桶结构域的系统发育分析显示Treponema和Borrelia谱系之间存在明显的分化，其中Treponema表现出更高的序列
讨论
通过系统发育分析、计算结构预测、蛋白质组相互作用筛选和蛋白相互作用验证，本研究鉴定并表征了T. pallidum中一种先前未被识别的BamD样蛋白Tp0625，并将其确认为该菌BAM复合物的关键组分。我们的发现支持T. pallidum中存在高度多样化但功能保守的BAM系统，并为这一病原体如何组装其稀疏
CRediT作者贡献声明
吴思睿：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、方法学、调查、形式分析、数据整理、概念化。叶飞：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、资源、方法学、调查、概念化。辛家宝：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、方法学、形式分析、数据整理。林西：撰写—审阅与编辑、方法学、调查、资金获取。黄一可：
资金来源
本工作由中国国家自然科学基金（编号：82502792）和中国四川省自然科学基金（编号：2025ZNSFSC1747）资助。
致谢
感谢杨天驰博士提供T. pallidum的完整基因组和T. pallidum菌株。感谢路广文实验室成员在实验过程中提供必要的设备和技术支持。
吴思睿|叶飞|辛家宝|林西|黄一可|陈新莹|李静|邓杰伦|王远方|李东东
