《International Journal of Biological Macromolecules》：Chondroitin sulfate and collagen peptides co-derived from sturgeon cartilage: Characterization and combined effects on IL-1β-induced chondrocyte inflammation
in vitro
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摘要骨关节炎 (OA) 是一种主要的关节疾病，其特征是软骨基质降解和炎症反应。硫酸软骨素和胶原蛋白肽是软骨细胞外基质的主要成分，与 OA 相关炎症具有潜在相关性。鲟鱼软骨作为主要的加工副产品，是这些生物活性组分的未被充分利用的来源。然而，关于它们的提取、表征以及对软骨细胞炎症
摘要
骨关节炎 (OA) 是一种主要的关节疾病，其特征是软骨基质降解和炎症反应。硫酸软骨素和胶原蛋白肽是软骨细胞外基质的主要成分，与 OA 相关炎症具有潜在相关性。鲟鱼软骨作为主要的加工副产品，是这些生物活性组分的未被充分利用的来源。然而，关于它们的提取、表征以及对软骨细胞炎症反应的联合作用研究尚不充分。在本研究中，分别从鲟鱼软骨中提取了硫酸软骨素和胶原蛋白肽。硫酸软骨素组分 1 (CS-1) 通过离子交换色谱获得，而胶原蛋白肽组分 3 (CP-F3) 通过酶解、超滤和凝胶过滤色谱制备。CS-1 主要为硫酸软骨素 -4 硫酸酯，重量平均分子量约为 3.0 × 105 Da。CP-F3 是一个低分子量胶原蛋白肽组分，富含 m/z 500 以下的肽相关离子。在 IL-1β 诱导的炎症模型中，在 SW1353 软骨样细胞中，CS-1 和 CP-F3 联合治疗增加了蛋白聚糖和 II 型胶原蛋白的保留，降低了 NO、iNOS、COX-2、PGE2 和 IL-6 水平，并恢复了 MMP-3/MMP-13/TIMP-1 平衡。这些效应可能与 TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的调节有关。总体而言，这些发现提供了初步的体外证据，表明 CS-1 和 CP-F3，特别是联合使用时，可能减轻炎症和基质降解反应。需要进一步的体内和机制研究来阐明它们对软骨保护的相关性。
引言
骨关节炎 (OA) 是一种常见的慢性关节疾病，最常影响手部、膝盖、髋部和脊柱关节 [1]、[2]。该病表现为关节疼痛、僵硬和活动受限，严重影响生活质量。全球有超过 6 亿人受 OA 影响，且对老年人的负担不成比例，使其成为老龄化人口残疾的主要原因。预计随着全球人口老龄化的同步发展，OA 的发病率将进一步上升 [3]、[4]。迄今为止，OA 尚无明确治愈方法，当前治疗策略侧重于症状管理。非甾体抗炎药 (NSAIDs) 在临床上用于缓解疼痛；然而，它们既不能诱导完全缓解也不能阻止疾病进展。此外，长期使用 NSAID 与严重的不良反应有关，包括胃肠道出血和心血管并发症。鉴于这些局限性，人们对更安全的天然或营养干预措施作为替代方案日益关注。然而，合理开发这些天然生物活性组分需要对 OA 发病机制背后的分子机制有更深入的了解。OA 的发病机制由复杂的炎症级联反应驱动，其中促炎细胞因子，特别是白细胞介素 -1 β (IL-1β)，起着核心作用。IL-1β 与其同源受体和共受体结合后，招募接头蛋白并激活下游激酶信号，导致 IκB 磷酸化和降解，随后核因子 κB (NF-κB) p65 发生核转位。这驱动了诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)、环氧合酶 -2 (COX-2) 和白细胞介素 -6 (IL-6) 的转录上调，共同创造了以产生一氧化氮 (NO) 和前列腺素 E2 (PGE2) 升高为特征的分解代谢微环境。同时，NF-κB 介导的基质金属蛋白酶 -3 (MMP-3) 和基质金属蛋白酶 -13 (MMP-13) 上调，以及基质金属蛋白酶组织抑制剂 -1 (TIMP-1) 活性降低，破坏了蛋白酶 - 抗蛋白酶平衡并加速了 II 型胶原蛋白和蛋白聚糖的降解，最终损害软骨结构完整性 [5]、[6]、[7]。这些发现表明，靶向 IL-1β/NF-κB 轴可能是评估天然化合物作为软骨保护剂的可行方法。
近年来，如硫酸软骨素和胶原蛋白肽（特别是 II 型胶原蛋白衍生肽）等天然生物活性化合物，因其支持软骨基质稳态和调节 OA 相关炎症反应的作用，作为营养保健品原料受到越来越多的关注 [8]、[9]。据报道，硫酸软骨素通过抑制基质金属蛋白酶的表达到抑制软骨细胞外基质 (ECM) 的降解，而胶原蛋白肽则显示出促进软骨细胞增殖和刺激 II 型胶原蛋白合成的作用 [10]、[11]。然而，大多数商业可用的 CS 和 II 型胶原蛋白来源均源自陆生动物，包括猪、牛、家禽或鲨鱼，这不仅提出了伦理问题，还存在与人畜共患病（如牛海绵状脑病和猪瘟）相关的风险 [12]、[13]。此外，为提取 CS 和胶原蛋白而过度捕捞鲨鱼引发了严重的可持续性和保护问题 [14]、[15]、[16]。这些担忧共同推动了人们对替代来源的关注，特别是海洋鱼类如鲟鱼，它们为提取这些生物活性化合物提供了更可持续和安全的选项。
鲟鱼软骨是 CS 和胶原蛋白肽的丰富来源，已作为传统陆生来源的有前景的替代方案出现。鲟鱼来源的 CS 显示出与传统来源相当的结构特征，但具有更均匀的硫酸化模式和分子量分布，这可能有助于其生物活性和抗炎潜力 [17]、[18]、[19]、[20]。此外，源自鲟鱼软骨的胶原蛋白肽，主要源自 II 型胶原蛋白，显示出与人体关节软骨高度兼容的组成和结构特征 [21]、[22]、[23]。此外，与其他动物来源的胶原蛋白相比，它们表现出降低的抗原性，使其不太可能引发过敏反应 [24]、[25]。这些优势使鲟鱼软骨成为开发生物活性组分的有前景的海洋来源，潜在应用于 OA 预防和软骨保护。
尽管先前的研究描述了鲟鱼来源的硫酸软骨素和胶原蛋白肽各自的生物活性 [26]、[27]，但很少关注从同一生物来源获得这两类生物活性组分，在相同的实验条件下并列评估它们，并确定它们的联合使用是否产生比单独使用任一组分更大的效果。此外，在 IL-1β 诱导的软骨细胞炎症条件下，它们的联合作用及相关细胞反应尚未进行系统研究。在本研究中，我们提取、分离和表征了鲟鱼软骨来源的硫酸软骨素 (CS-1) 和低分子量胶原蛋白肽组分 (CP-F3)。使用 IL-1β 刺激的炎症模型在 SW1353 软骨样细胞中，我们评估了 CS-1 和 CP-F3 的抗炎效果，无论是单独还是联合，特别关注它们的联合使用是否产生比单独使用任一组分更大的炎症减轻。还研究了与这些效果相关的 toll 样受体 4 (TLR4)/髓样分化主反应基因 88 (MyD88)/NF-κB 信号通路的变化。本研究的发现预计将为鲟鱼软骨副产品的高值化利用提供理论基础，并支持开发潜在与软骨健康管理相关的天然生物活性成分。
章节摘要
材料和试剂
胃蛋白酶 (CAS 9001-75-6) 和胰蛋白酶 (CAS 9002-07-7) 购自 Sigma-Aldrich (美国密苏里州圣路易斯)；Q Sepharose Fast Flow (货号 17051004) 购自 Cytiva (美国密苏里州圣路易斯)；高效 RIPA 组织/细胞快速裂解液（含 PMSF：蛋白酶抑制剂，货号 R0010）和邻苯二甲醛 (OPA, CAS 643–79-8) 购自北京索莱宝科技有限公司 (北京，中国)。胰蛋白酶 -EDTA (货号 C0203)，青霉素 - 链霉素溶液 (货号 C0222)，IL-1β
鲟鱼软骨硫酸软骨素的纯度
鲟鱼软骨硫酸软骨素的梯度洗脱如图 1a 所示。基于梯度洗脱曲线，确定了两个主要组分的洗脱条件并命名为 CS-0 和 CS-1。由于 CS-1 占总糖胺聚糖的较大比例 (约 72.3%)，本研究主要关注 CS-1。我们之前的研究表明，CS-1 被确认为由 →4GlcAβ1 → 3GalNAc4Sβ1 → 和微量组成的硫酸软骨素 -4 硫酸酯
结论
在本研究中，从同一鲟鱼软骨来源获得了硫酸软骨素和胶原蛋白，并进一步加工得到 CS-1 和活性导向的胶原蛋白肽组分 CP-F3。CS-1 被表征为主要为硫酸软骨素 -4 硫酸酯，而 LC-MS/MS 和 PEAKS de novo 分析显示 CP-F3 含有多种低分子量肽候选物。在 IL-1β 刺激的 SW1353 细胞中，两种组分都与炎症和基质相关变化有关
CRediT 作者贡献声明
Cheng Ji: 撰写 – 初稿，数据管理。 Chunyu Niu: 验证，监督。 Qi Liu: 方法论，数据管理。 Yan Chen: 方法论，数据管理。 Qi Zeng: 撰写 – 审阅与编辑，构思。 Yin Chen: 撰写 – 审阅与编辑，项目管理，资金获取，构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能已被认为会影响本论文报告的工作。
致谢
本工作得到了浙江省自然科学基金（中国） (LTGS23D060001) 和 浙江省自然科学基金 (ZCLTGN24C1801) 的支持。
Cheng Ji|Chunyu Niu|Qi Liu|Yan Chen|Qi Zeng|Yin Chen
