重构CYP11A1耦合电子传递提升酵母中孕酮的从头合成

《Metabolic Engineering》：Rewiring CYP11A1-coupled electron transfer boosts de novo progesterone production in yeast

　　

脊椎动物来源的CYP11A1可通过与II类电子传递系统（ETS）偶联实现催化活性，具体为细胞色素P450还原酶（CPR）。
• 人工智能辅助的蛋白质工程鉴定出SsCYP11A1的F75S突变是调控SsCYP11A1-AoCPR相互作用界面残基柔性的关键决定因素，从而增强界面相互作用并提高整体催化性能。
• 破坏液泡铁转运蛋白CCC1可增强酵母细胞质中I类ETS的功能。
• I类ETS和II类ETS的协同利用促进了酵母中克级水平的孕酮从头生物合成。

## 引言

孕酮（P4）是一种C21天然孕激素，在女性中由卵巢黄体合成，在妊娠期间则由胎盘合成。它在调节月经周期、维持妊娠和支持辅助生殖方面发挥着重要作用，同时还作为一种神经类固醇参与多种非生殖过程（Bulletti等人，2022；Taraborrelli，2015）。传统的孕酮化学合成方法由宾夕法尼亚州立大学的Russell Marker及其同事于20世纪40年代开发，以薯蓣皂素为起始原料，通过甾体侧链裂解、重排和选择性Oppenauer氧化进行（Marker和Krueger，1940）。该路线成本高昂，产生大量废水和残渣，造成严重的环境负担。酿酒酵母具有麦角甾醇生物合成途径，可通过代谢工程改造，从简单碳源出发从头生产孕酮。1998年，Pompon及其同事将牛源性胆固醇侧链裂解酶（P450scc，又称CYP11A1）和人类3β-羟基甾体脱氢酶（3β-HSD）引入酿酒酵母，实现了酵母中脱氢孕烯醇酮和孕酮的首次异源从头合成；然而，原生CYP11A1活性较差，导致孕酮滴度低于100 mg/L（Duport等人，1998）。

直到最近，酵母中孕酮从头合成的重大进展主要得益于植物源性胆固醇侧链裂解酶的发现。2023年，Carroll等人首次鉴定出毛地黄属植物Digitalis lanata中的CYP87A在功能上与脊椎动物CYP11A1类似。该酶在烟草中的表达表明其能够将胆固醇和β-谷甾醇转化为孕烯醇酮，从而启动地高辛的生物合成（Carroll等人，2023）。同年，Kunert及其同事独立报道了CYP87A的研究。通过在产生胆固醇的酵母菌株RH6829中共表达来自Digitalis purpurea和Calotropis procera的CYP87A酶（DpCYP87A106和CpCYP87A103）以及拟南芥细胞色素P450还原酶1（AtCPR1），他们实现了孕烯醇酮的生产（Kunert等人，2023）。2025年，Chen等人通过在大田黄精（Rehmannia glutinosa）的RgCYP87A3基因在酿酒酵母中表达，并将其催化口袋中引入酸性残基以加速去质子化和质子偶联电子转移（PCET），进一步提高了CYP87A的催化效率。结合其他代谢工程改造，该方法在5 L发酵罐中获得了0.83 g/L的孕烯醇酮产量（Chen等人，2025）。同年，Li等人从药用植物Marsdenia tenacissima中鉴定出参与孕酮生物合成的四种关键酶，包括两种CYP87A酶（MtCYP108和MtCYP150）和两种3β-羟基甾体脱氢酶/Δ5-Δ4酮甾体异构酶（MtHSD5和MtHSD6）。通过在酿酒酵母中重建植物孕酮途径，他们实现了克/升级别的孕酮从头合成（1.06 g/L）（Li等人，2025）。相比之下，脊椎动物源性CYP11A1在酵母中的应用在过去27年间进展缓慢。2019年，Zhang等人通过筛选不同物种的CYP11A1及其相关ETS组分并优化其表达水平，在Lipomyces lipolytica中实现了高达78.0 mg/L的孕烯醇酮产量（Zhang等人，2019）。然而，此后未再报道CYP11A1在酵母中的进一步显著改进。

细胞色素P450酶（CYP）可根据其电子传递系统的组成和电子供体的模式进行分类（Hannemann等人，2007）。脊椎动物CYP11A1是一种典型的I类细胞色素P450酶，定位于线粒体内膜（Hannemann等人，2007）。该酶催化胆固醇的连续三步氧化反应，包括C22和C20位羟基化以及C20和C22之间碳碳键的裂解，最终生成孕烯醇酮和异己醛（Strushkevich等人，2011）。该催化过程需要两个氧化还原伙伴：定位于线粒体内膜的黄素蛋白肾上腺醇脱氢酶（AdR），以及定位于线粒体基质的铁硫蛋白肾上腺醇（Adx）。AdR从NADPH接受电子，而Adx在CYP11A1和AdR之间传递电子（Hannemann等人，2007；Miller和Auchus，2011；Strushkevich等人，2011）。在酵母中，甾醇生物合成主要发生在内质网（ER）膜上。一部分合成的甾醇被转运至质膜以维持膜完整性，另一部分在ER中酯化为甾醇酯并储存于脂滴中（Zinser等人，1993）。因此，为提高底物可及性，以往研究去除了CYP11A1、Adx和AdR的线粒体靶向序列，并将其重新定位于非线粒体区室。CYP11A1主要定位于质膜，而Adx和AdR则分别分布于细胞质和内质网，从而形成跨细胞器ETS（Duport等人，2003）。尽管该系统具有功能活性，但存在明显局限性。一方面，Adx需要[2Fe-2S]簇作为辅因子，而酵母细胞质中[2Fe-2S]簇的可用性受到严格调控且有限（Braymer等人，2024），导致电子传递效率低下。另一方面，CYP11A1、Adx和AdR在空间上的分离显著限制了有效的电子传递。这些因素共同限制了整体电子传递效率和催化通量，制约了CYP11A1介导的甾体生物合成。相比之下，植物P450scc（CYP87A）属于II类CYP家族。CYP87A是一种锚定于ER的单次跨膜蛋白，尽管执行相似的生化功能，但与CYP11A1仅有约30%的序列一致性（Li等人，2025）。CYP87A可从定位于ER的NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）接受电子，实现空间偶联的电子传递（Li等人，2025）。总之，与脊椎动物原生P450scc系统相比，植物源性P450scc系统具有简化电子传递链且不依赖铁硫簇的优势。这些优势共同促进了酵母中孕烯醇酮或孕酮的高效生物合成。

有假说认为线粒体CYPs可能进化自微粒体CYPs（Hartz等人，2021；Omura和Gotoh，2017），这暗示CYP11A1可能保留与CPR的潜在兼容性。近期研究表明，知母（Anemarrhena asphodeloides）的一种CPR可以驱动CYP11A1介导的催化（Li等人，2022）。尽管效率相对较低，但这一发现表明，重建ETS以模拟植物型P450scc系统可能是提高CYP11A1催化效率的有效策略。基于这一理念，本研究系统地重建了CYP11A1的ETS。我们首先通过筛选不同的CYP11A1-CPR组合建立了非天然P450scc系统，使CYP11A1能够与II类ETS偶联。随后，我们增强了酵母细胞质中[2Fe-2S]簇的可用性，从而改善了CYP11A1原生I类ETS的功能。最后，通过整合I类ETS和II类ETS，我们显著提高了CYP11A1的催化效率。

## 试剂

以下标准化学品购自上海源叶生物科技有限公司（中国，http://www.shyuanye.com）：孕酮（目录号：B20572）、孕烯醇酮（S31603）、菜油甾醇（S31679）、胆固醇（S23165）、羊毛甾醇（S27466）、二氢羊毛甾醇（S27673）。22(R)-羟基胆固醇（目录号：H9384）购自Sigma-Aldrich（https://www.sigmaaldrich.cn），角鲨烯（目录号：S109119）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。

## CYP11A1-CPR偶联实现催化活性

CYP11A1催化油菜甾醇、胆固醇和22(R)-羟基胆固醇转化为孕烯醇酮。为确定CYP11A1的最佳底物，我们在酵母中构建了底物特异性生物合成途径。使用我们先前开发的高角鲨烯生产底盘菌株BY-T30（Shi等人，2021），我们将不同组合的外源基因整合至ERG5位点。包括来自马铃薯（Solanum tuberosum）的StDWF5（编码Δ7-脱氢胆固醇还原酶）。

## 讨论

自Duport等人1998年的开创性工作证明酿酒酵母中可以从头合成孕酮以来，向规模化生产的推进因CYP11A1催化效率低下而受到限制。细胞色素P450酶的性能不仅取决于其固有活性，还取决于充足的底物供应和高效的电子传递。在脊椎动物细胞中，CYP11A1定位于线粒体内膜，该处胆固醇水平极低（<5%）（Miller和

## 结论

总之，本研究通过系统性重塑CYP11A1偶联的ETS，大幅提高了酵母中孕酮的从头生物合成水平（图9）。通过使CYP11A1高效利用CPR作为电子供体，并通过增强[2Fe-2S]辅因子可用性优化Adx/AdR，我们有效缓解了与CYP11A1功能相关的长期存在的底物供应和电子传递瓶颈。这些进展不仅证明了实现

## CRediT作者贡献声明

马凯宇：调查研究。李根：调查研究。张荣鑫：调查研究。范绪泉：原创稿件撰写、可视化、方法论、调查研究、概念化。张学礼：稿件审阅与编辑、监督、项目管理、方法论、资金获取、概念化。范飞宇：稿件审阅与编辑、可视化、监督、项目管理、方法论、资金获取、概念化。温启龙：调查研究。

## 利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

## 致谢

我们衷心感谢天津工业生物技术研究所高级工程师姚永红在GC-MS分析方面的协助。本研究得到国家重点基础研究发展计划（杰出青年科学基金项目，编号：32225031）、国家自然科学基金基础科学中心项目（编号：32488301）和国家自然科学基金面上项目（编号：32271482）的资金支持。

范绪泉 | 张荣鑫 | 李根 | 马凯宇 | 温启龙 | 范飞宇 | 张学礼