计算启发的糖工程化以最大化单克隆抗体β4-半乳糖基化

《Metabolic Engineering》：Computationally inspired glycoengineering to maximise mAb β4-galactosylation

　　

摘要翻译：
•双重COSMC敲除与β4GalT1过表达可实现>90%的单克隆抗体Fc区半乳糖基化。
•COSMC敲除将UDP-半乳糖从O-聚糖重定向至mAb Fc区，且不影响细胞生长。
•双重糖工程化可减少非期望的Man5₅聚糖的产生。

**论文解读：计算启发的糖工程化最大化单克隆抗体β4-半乳糖基化**

单克隆抗体（mAb）是当前商业上最成功的生物制药，其Fc片段Asn297残基上的N-连接糖基化是决定治疗活性的关键因素。其中，末端β4-半乳糖基化可增强补体依赖性细胞毒性（CDC）、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）等效应功能，对mAb疗效有重要影响。然而，mAb Fc β4-半乳糖基化在临床产品中也表现出显著的批间变异性，且对培养条件高度敏感。已有研究指出，β-1,4-半乳糖基转移酶1（β4GalT1）的细胞机器可用性和UDP-半乳糖（UDP-Gal）核苷酸糖供体（NSD）的供应是限制半乳糖基化的两大瓶颈。此外，UDP-Gal还必须同时用于细胞O-聚糖的合成——由核心1 β-1,3-半乳糖基转移酶（C1GalT1）消耗，构成一个被忽视的代谢竞争约束。因此，该研究旨在同时解除酶机器与代谢瓶颈，以实现mAb Fc β4-半乳糖基化的最大化。

研究人员在两种产mAb的中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞系——CHO-DP12（表达抗IL-8 mAb）和CHO-VRC01（表达抗HIV-1广泛中和抗体）——中进行了双管齐下的基因工程改造：利用CRISPR/Cas9敲除COSMC（C1GalT1的正确折叠与活性所必需的分子伴侣），阻断O-聚糖的β3-半乳糖基化；同时通过质粒转染过表达人β4GalT1（hβ4GalT1）。由此构建了四种细胞变体：Parental（野生型）、COSMC-（单敲除）、GalT+（单过表达）和C-/GT+（双重改造）。在批式和流加培养模式下系统表征了生长动力学、mAb滴度、Fc糖谱、胞内核苷酸/NSD水平及细胞表面半乳糖基化。该研究发表在《Metabolic Engineering》期刊上。核心结论是：C-/GT+策略可在两种宿主和两种培养模式下稳定地将mAb Fc β4-半乳糖基化推至>90%，同时抑制非期望的Man5₅聚糖产生，且不损害细胞生长和产量，甚至在某些条件下还提高了培养性能。

该研究用到的主要关键技术方法包括：基于pX458质粒的CRISPR/Cas9敲除COSMC，并通过VVL凝集素辅助流式细胞术（FACS）富集阳性细胞；基于pUNO1-hb4galt1质粒的hβ4GalT1过表达，结合杀稻瘟菌素抗性筛选；使用IdeS蛋白酶消化和液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行Fc糖谱解析；采用离子对反相HPLC定量细胞内核苷酸及NSD；运用凝集素ECL结合流式细胞术评估细胞表面N-连接β4-半乳糖基化。样本来源为CHO-DP12（ATCC CRL-12445，购自LGC Standards并适应无血清悬浮培养）和CHO-VRC01（由美国NIH疫苗研究中心提供）。

**3.1 生成CHO DP12和CHO VRC01糖变体细胞池**
通过CRISPR/Cas9敲除COSMC后，利用VVL凝集素（特异性识别Tn抗原）辅助FACS分选富集敲除细胞；随后用pUNO-hβ4GalT1转染并施加杀稻瘟菌素筛选，最终获得稳定的COSMC-、GalT+和C-/GT+细胞池，并经PCR确认hβ4GalT1基因整合。

**3.2 C-/GT+糖工程化在批式培养中提高mAb β4-半乳糖基化**
在批式培养中，DP12的GalT+和C-/GT+细胞均显著增加A2G2F糖型（分别达77.9%±1.5%和78.6%±2.8%）；C-/GT+的总半乳糖基化（96.0%±0.6%）显著高于GalT+（92.5%±0.3%），主要因C-/GT+的A2G0F更低。VRC01细胞中，C-/GT+的A2G2F（80.3%±0.6%）显著高于GalT+（72.0%±4.6%）。结果提示β4GalT1过表达先行解除酶瓶颈后，UDP-Gal供应成为次要限制，而COSMC敲除进一步释放UDP-Gal。

**3.3 糖变体在批式培养中的性能**
DP12中，C-/GT+细胞的峰值活细胞密度（VCD）和积分活细胞密度（IVCD）最高，但比生产速率（qp）略低；GalT+滴率较Parental低约12.65%。VRC01中，各糖变体VCD谱相似，但COSMC-、GalT+和C-/GT+的终末mAb滴度分别比Parental高5.39%、10.13%和12.18%，qp也相应提高。

**3.4 C-/GT+糖工程化在流加培养中提高mAb β4-半乳糖基化**
流加培养中，DP12的GalT+细胞比C-/GT+多产生10.4%±1.7%的A2G0F，且A2G2F少22.5%±6.1%；VRC01的GalT+比C-/GT+多产生11.0%±4.1%的Man5₅，且A2G2F少14.1%±3.0%，总半乳糖基化低11.3%±2.8%。这说明在更长的代谢压力培养中，COSMC敲除补充UDP-Gal的作用更加明显，并显著抑制Man5生成。

**3.5 糖变体在流加培养中的性能**
DP12中，GalT+和C-/GT+的峰值VCD和IVCD略低于Parental，但C-/GT+的终末滴度与Parental相当；GalT+滴度最低。VRC01中，GalT+和C-/GT+的峰值VCD、IVCD和终末滴度约为Parental的两倍（滴度>1.3 g/L），且qp提高约20%，代谢分析显示这两种变体葡萄糖摄取降低、乳酸生成减少，并从谷氨酰胺消耗转变为净生成，整体代谢效率更高。这种性能提升仅见于VRC01背景，可能与稳定转染池的位点整合和池组成差异有关。

**3.6 糖工程化影响细胞表面β4-半乳糖基化**
用ECL凝集素染色结合流式细胞术检测细胞表面N-连接β4-半乳糖基化（CSG），结果显示C-/GT+细胞的染色指数（SI）在批式和流加培养中均最高，且流加培养中GalT+与C-/GT+的差异也达到显著水平。这证明工程事件不仅影响mAb产物，也重塑了宿主细胞自身的糖蛋白糖基化模式。

**3.7 糖工程化对胞内核苷酸和NSD池的影响**
通过离子对HPLC定量胞内NSD和核苷酸磷酸盐，发现DP12的COSMC-细胞在培养后期出现UDP-Gal积累，与此前预期一致（O-聚糖合成被阻断）。然而，总体NSD数据并未与“UDP-Gal需求减少导致UTP增多进而抑制Man5”的简单模型完全吻合：GalT+和C-/GT+细胞的UTP池反而高于Parental细胞，且UTP水平与VCD/IVCD的相关性比与糖基化水平更强，提示UTP的主要去向是支持细胞生长的RNA合成。尽管如此，不能排除UTP对Man5调节存在较微弱的潜在贡献，且可能被生长效应掩盖。

在讨论部分，研究人员提出了一个综合机制模型：单独过表达β4GalT1会急剧增加N-连接半乳糖基化对UDP-Gal的消耗，导致UTP竞争性缺乏，削弱UDP-GlcNAc合成，使N-聚糖加工停滞在Man5阶段；同时，大量β4GalT1蛋白可能螯合细胞内Mn²⁺，抑制Mgat1（负责从Man5进入复合型聚糖的关键酶）的活性，进一步促进Man5释放。COSMC敲除则消除了O-聚糖这一UDP-Gal消耗“汇”，并将Mn²⁺从C1GalT中释放出来，从而同时缓解UDP-Gal、UTP和Mn²⁺的竞争压力，使C-/GT+细胞既能保持高β4-半乳糖基化，又能有效抑制Man5。该机制的稳健性还体现在批式和流加两种模式下均能获得>90%的半乳糖基化，且使用混合细胞池即可实现，提示其抗工艺波动能力较强。从治疗角度看，高的β4-半乳糖基化有利于增强CDC、ADCC和ADCP效应，并为下游唾液酸化提供底物；而Man5减少则有助于避免甘露糖受体介导的快速清除和潜在免疫原性风险。

**结论与展望**
该研究确立了一种通过两个工程事件（COSMC敲除和β4GalT1过表达）同时解除酶、代谢和辅因子瓶颈的策略，可在不到六周内获得稳定的高半乳糖基化CHO细胞池。C-/GT+策略在批式和流加培养中一致实现>90%的mAb Fc β4-半乳糖基化，并且比单一β4GalT过表达更有效地抑制Man5产生。该机制框架以UDP-Gal、UTP和Mn²⁺的再分配为核心，为未来针对其他聚糖基序的糖工程化设计提供了理性基础，并可进一步与唾液酸化工程或不同mAb格式相结合，以拓展其应用价值。