长链非编码RNA（lncRNA）RAMS11依赖的NOTCH3激活驱动非小细胞肺癌肿瘤进展

《NAR Cancer》：LncRNA RAMS11-dependent NOTCH3 activation drives tumor progression in non-small cell lung cancer

　　

肺癌目前是全球癌症相关死亡的首要原因。约85%的肺癌患者为非小细胞肺癌（NSCLC），其中超过50%患者在初始诊断时即出现转移。尽管对肺癌致癌机制的理解有所进展，但肺癌如何变得具有侵袭性并导致患者死亡的机制仍知之甚少。研究人员发现，长链非编码RNA、与转移相关的RNA 11（RAMS11；LINC01564）在肺癌患者中较健康人群显著上调。本研究显示，RAMS11通过调控关键致瘤驱动因子NOTCH3的表达，对NSCLC肿瘤进展至关重要。机制上，RAMS11对NRF2在NOTCH3增强子区域的染色质结合以及活性增强子标志H3K27ac的沉积必不可少。功能分析表明，RAMS11–NRF2依赖的NOTCH3信号激活增强了自我更新能力与肿瘤起始能力，从而支持恶性增殖。此外，破坏RAMS11信号可显著抑制致瘤性生长，并使NSCLC细胞对顺铂诱导的凋亡敏感，揭示了一个可靶向NSCLC的潜在治疗弱点。这些发现揭示了RAMS11在NSCLC进展与化疗耐药中此前未知的作用。

研究背景：肺癌是当前癌症相关死亡的首要原因，非小细胞肺癌（NSCLC，non-small cell lung cancer）约占所有肺癌的85%，超过半数患者在初诊时已发生转移，晚期患者5年生存率低于10%。尽管长链非编码RNA（lncRNA，long noncoding RNA）在肿瘤中的调控作用被广泛关注，但NSCLC如何获得侵袭性、化疗抵抗及肿瘤起始特性的机制仍不清楚。研究人员此前通过泛癌转录组分析鉴定出与转移相关的lncRNA RAMS11（RNA-associated with metastasis 11），其在包括肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）在内的多种实体瘤中异常表达，并在结肠癌、肝癌、胶质瘤中被证明可通过不同机制促进肿瘤发生。然而，RAMS11在NSCLC中如何调控下游靶基因、是否与NRF2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，由NFE2L2编码）通路交叉并驱动NOTCH3表达，尚缺乏系统研究。因此，研究人员围绕RAMS11–NRF2–NOTCH3轴在NRF2组成型激活型NSCLC中的功能与机制展开研究，论文发表于《NAR Cancer》。

主要关键技术方法：研究人员使用来自TCGA及韩国人群的肺鳞癌、肺腺癌及配邻正常组织转录组队列作为发现基础；在KEAP1突变型A549、H460、H838与NRF2野生型H23细胞中进行RNA测序（RNA-seq）、RT-qPCR、蛋白质印迹（western blot）、染色质免疫沉淀qPCR（ChIP-qPCR）；通过慢病毒递送CRISPR/Cas9或CasRx系统构建RAMS11敲除、KEAP1缺失及RAMS11过表达模型；采用肿瘤球形成与极限稀释分析（ELDA）评估肿瘤起始能力；以 resazurin 法检测顺铂与吉西他滨药敏，并以Annexin V流式细胞术分析凋亡。

LncRNA RAMS11 drives expression of NOTCH3 in non-small cell lung cancer：研究人员在A549与H838中敲低RAMS11后进行RNA-seq，发现331个共同调控基因，并与Drug-Gene Interaction Database（DGIdb）交叉，确定NOTCH3为最受抑制且具有临床可成药性的基因；RT-qPCR与western blot证实RAMS11敲低降低NOTCH3 mRNA与活化型NOTCH3（NICD3）蛋白，过表达则升高NOTCH3、HES1与HEY1；NOTCH3敲低背景下过表达RAMS11可部分恢复NICD3，说明RAMS11是NOTCH3转录与蛋白表达的必要且充分上游正调控因子。

RAMS11 regulates NRF2 occupancy to transcriptionally regulate NOTCH3 expression：ChIP-qPCR显示，RAMS11敲低显著降低NRF2在NOTCH3增强子（位于转录起始位点上游约10 kb、含抗氧化反应元件ARE）的占位及H3K27ac活性增强子标志沉积；在H23中通过CRISPR使KEAP1失活可激活NRF2并升高NOTCH3，再敲低RAMS11则使NRF2占位、H3K27ac与NOTCH3表达回降至对照水平；NRF2缺失时RAMS11过表达不能恢复NOTCH3，表明RAMS11作为NRF2的正协同激活因子，调控NOTCH3增强子开放与转录。

RAMS11 is required for NSCLC tumor cell growth and tumorigenicity：研究人员在低贴附无血清干细胞条件下富集肿瘤起始细胞（TIC）样群体，发现肿瘤球中RAMS11与NOTCH3升高；RAMS11敲低减少集落形成与肿瘤球数量、面积，ELDA显示肿瘤起始频率下降，干性基因OCT4、NANOG、PROM1下调；过表达RAMS11则增强上述表型，证明RAMS11维持NSCLC细胞增殖与肿瘤起始自我更新。

RAMS11 knockdown increases chemotherapy efficiency：resazurin实验显示，A549与H460中敲低RAMS11后，顺铂与吉西他滨处理下存活率下降，IC₅₀降低；H23中RAMS11过表达则耐药增强、IC₅₀升高，说明RAMS11是NSCLC化疗反应与疗效的关键调节因子。

Decreased RAMS11 expression inhibits NOTCH3-dependent tumor growth：采用CasRx持续敲低RAMS11，在顺铂处理下增殖受抑更明显；基因集富集分析（GSEA）显示凋亡通路富集，CDKN1A（p21）、CDKN1B（p27）、BAX、FAS、GADD45a、TP53上调；Annexin V检测表明RAMS11缺失本身不引发凋亡，但显著增强顺铂诱导的caspase依赖性凋亡，zVAD-fmk可阻断该死亡，说明RAMS11通过抑制凋亡轴产生化疗抵抗。

NOTCH3 functions downstream of lncRNA RAMS11 to promote aggressive phenotypes：在RAMS11缺失细胞中回补NOTCH3（NICD3），可恢复集落形成能力，降低顺铂诱导凋亡比例，并使顺铂IC₅₀回升，证实NOTCH3位于RAMS11下游，足以挽救增殖缺陷、耐药与抗凋亡表型。

讨论部分总结：研究人员指出，RAMS11作为onco-lncRNA，在NRF2激活型NSCLC中扮演NOTCH3上游共激活因子，不同于其在结肠癌通过CBX4、肝癌通过miR-107/103a-3p–PHGDH、胶质瘤通过SRSF1–MAPK8–NFE2L2的机制，本文揭示其通过引导NRF2结合NOTCH3增强子并维持H3K27ac活性染色质状态，从而驱动干性、增殖与化疗耐药。该RAMS11–NRF2–NOTCH3轴为KEAP1/NFE2L2突变型NSCLC提供了可干预的转录调控靶点，也提示NOTCH3作为临床可成药节点与RAMS11表达状态可用于疗效预测。

研究结论部分翻译：在既往工作中，研究人员鉴定出RAMS11在包括肺癌在内的五种癌症类型中差异表达。更具体地说，RAMS11在LUSC与LUAD中大多上调；本研究进一步证明，RAMS11是NRF2激活型NSCLC中NOTCH3的必要且充分的正向调控因子。机制上，RAMS11引导NRF2占据NOTCH3增强子并促进H3K27ac沉积，从而激活NOTCH信号、增强肿瘤起始能力与自我更新。功能上，RAMS11缺失削弱致瘤生长并增加顺铂诱导的凋亡，而NOTCH3回补可挽救该表型。综上，RAMS11–NRF2–NOTCH3轴代表NRF2组成型激活NSCLC中的新治疗脆弱点，靶向RAMS11或NOTCH3有望克服NRF2驱动型肺癌的进展与化疗耐药。