《Diamond and Related Materials》：Formulation and in vitro evaluation of Berberine-loaded ZnO/g-C
3N
4 nanocomposites as a multifunctional platform for anticancer applications
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摘要小檗碱是一种具有显著抗癌潜力的天然生物碱；然而，由于其水溶性差和生物利用度低，其治疗应用受到限制。本文制备了石墨氮化碳（g-C?N?）、ZnO/g-C?N?、负载小檗碱的g-C?N?（BER@g-C?N?）和负载小檗碱的ZnO/g-C?N?（BER@ZnO/g-C?N?）
摘要
小檗碱是一种具有显著抗癌潜力的天然生物碱；然而，由于其水溶性差和生物利用度低，其治疗应用受到限制。本文制备了石墨氮化碳（g-C?N?）、ZnO/g-C?N?、负载小檗碱的g-C?N?（BER@g-C?N?）和负载小檗碱的ZnO/g-C?N?（BER@ZnO/g-C?N?），并对其抗癌应用进行了评估。利用X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、热重分析（TGA）、扫描和透射电子显微镜（SEM和TEM）、能量色散X射线光谱（EDX）以及动态光散射分析（用于粒径和Zeta电位测定）对所制备材料进行了表征。BER@g-C?N?和BER@ZnO/g-C?N?均表现出优异的载体包封效率（>95%），其中载体与药物的比例分别为80:20和60:40的配方在包封效率、负载能力和合成产率之间取得了最佳平衡。体外释放研究表明，在生理条件（pH 7.4）下，纳米复合材料体系在72小时内对小檗碱表现出持续释放行为。在MCF-7人乳腺癌细胞上评估了四种样品的细胞毒性活性，并利用HFS正常成纤维细胞评估其生物相容性。BER@ZnO/g-C?N?对MCF-7细胞表现出显著的细胞毒性活性，而对HFS细胞的毒性相对较低，表明具有一定程度的选择性抗癌活性。BER@ZnO/g-C?N?抗癌性能的改善归因于小檗碱与ZnO/g-C?N?纳米结构之间的协同作用。然而，这一效应背后的具体细胞和分子机制仍需进一步研究。总体而言，这些发现突出了BER@ZnO/g-C?N?复合材料作为选择性抗癌疗法进一步研究的潜在平台。
引言
癌症仍然是全球重大的健康挑战，也是全世界发病率和死亡率的主要原因之一[1]。2020年，全球约有1930万例新发癌症病例和近1000万例癌症相关死亡[2]。乳腺癌是女性中最常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一。尽管癌症治疗取得了进展，但传统治疗方法往往受到全身毒性、选择性差、药物耐药性和治疗功效降低的限制[3]。因此，迫切需要开发更安全、更具选择性的治疗策略，以增强抗癌效果，同时尽量减少对健康组织的损害。
天然生物活性化合物因其多靶点药理活性和相对较低的毒性而成为有前景的抗癌药物[4]、[5]、[6]。小檗碱是一种异喹啉生物碱，存在于黄檗（Berberis vulgaris）等植物中[7]、[8]，通过抑制增殖、诱导凋亡和细胞周期阻滞以及调节多种信号通路而表现出显著的抗癌效果[9]、[10]。然而，其治疗应用受到水溶性差、代谢快和口服生物利用度低的限制[11]。因此，基于纳米载体的递送系统代表了增强小檗碱治疗效果的一种有前景的策略。
基于纳米技术的药物递送系统通过提高生物活性化合物的溶解度、稳定性和生物利用度，为克服这些局限性提供了一种可行的方法[12]、[13]。纳米载体可以保护敏感分子免受降解、实现持续或控制释放、增强细胞摄取，并实现对癌组织的目标递送[14]、[15]。在众多用于生物医学研究的纳米材料中，石墨氮化碳（g-C?N?）因其独特的物理化学和生物性质而近年来引起了广泛关注[16]。g-C?N?是一种由碳原子和氮原子组成的二维聚合物材料，具有共轭三s-三嗪结构[17]，提供了化学稳定性、高热阻性、大的比表面积和丰富的含氮官能团，有利于治疗分子的吸附或共轭[18]、[19]。此外，g-C?N?具有良好的生物相容性和较低的本征毒性，使其成为药物递送应用的理想候选材料[20]。
通过引入金属或金属氧化物纳米粒子（如氧化锌（ZnO）），g-C?N?的功能性能可以进一步增强[21]。ZnO纳米粒子（NPs）具有独特的光学、电子和生物性质，包括在生理条件下产生活性氧（ROS）的能力。ROS的产生可以选择性诱导癌细胞凋亡，而由于氧化应激反应的差异，正常细胞得以保留。此外，ZnO NPs提供了额外的药物吸附表面积、提高了稳定性，并可协同增强所负载治疗药物的细胞毒性活性[22]。因此，由ZnO NPs与g-C?N?整合而成的杂化纳米复合材料代表了多功能平台，结合了两种组分各自的优势[23]，包括高药物负载能力、结构稳定性和潜在的双重抗癌机制：药物介导的细胞毒性和ROS诱导的凋亡[24]。
已有几项研究探索了g-C?N?和ZnO基纳米复合材料在生物医学领域的应用，包括抗微生物疗法、光动力疗法、抗癌疗法和药物递送。H. Leelavathi等人[25]证明，用亲水性ZnO纳米粒子修饰疏水性g-C?N?（GCN）基抗癌药物可显著增强其对人类宫颈癌（HeLa）细胞的抗增殖活性，这可能是由于分散性和细胞摄取的改善所致。然而，鲜有研究系统探讨天然抗癌化合物与g-C?N?或ZnO@g-C?N?纳米复合材料的整合。Padmanabhan等人[21]研究了嵌入g-C?N?纳米片中的姜黄素负载ZnO纳米粒子（ZnO NPs/g-C?N?/Cur）的抗癌活性，证明其对乳腺癌细胞具有显著的细胞毒性效果。此外，诸如载体与药物重量比、包封效率、负载能力、纳米粒子合成产率、物理化学表征、药物持续释放行为以及针对癌细胞与正常细胞的选择性细胞毒性等重要参数仍缺乏充分探索。解决这些知识空白对于优化此类多功能纳米平台的治疗潜力和推进其在肿瘤学中的转化应用至关重要。
本研究旨在开发负载小檗碱的g-C?N?和ZnO@g-C?N?（BER@g-C?N?和BER@ZnO/g-C?N?）纳米复合材料，作为开创性的多功能抗癌平台。利用全面的物理化学技术对纳米复合材料进行合成和表征，包括X射线衍射（XRD）用于结晶度分析、傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于官能团分析、热重分析（TGA）用于热稳定性和药物负载确认、扫描和透射电子显微镜（SEM和TEM）用于形貌评估，以及动态光散射（DLS）用于粒径分布和Zeta电位测量。评估了不同的载体与药物重量比（50:50、60:40、70:30、80:20和90:10），以优化负载效率和纳米粒子产率。
此外，在37°C下的磷酸盐缓冲液中，在生理条件（pH 7.4）和酸性条件（pH 5.5）下进行了体外释放研究，以评估两种纳米复合材料中小檗碱的持续释放曲线。分别利用MCF-7人乳腺癌细胞和HFS正常成纤维细胞评估了制剂的细胞毒性和生物相容性，以确定抗癌效果和选择性。通过将天然抗癌化合物与多功能纳米载体相结合，本研究旨在提供一种综合方法来增强小檗碱的治疗潜力，同时最大限度地减少其局限性。
总体而言，本研究提供了一个系统的框架，用于开发创新的小檗碱负载ZnO@g-C?N?纳米复合材料作为选择性且有效的抗癌平台，结合了天然化合物的治疗优势与杂化纳米材料的结构和功能益处。本研究的成果有望为促进能够提高药物生物利用度、增强选择性细胞毒性并推进基于天然产物抗癌疗法临床转化的理性设计的目标导向多功能纳米载体做出贡献。
章节片段
材料
小檗碱盐酸盐水合物（纯度>98%）、三聚氰胺（99%）、2,2-二苯基-1-苦基肼基（DPPH）和磷酸盐缓冲液片剂（1×，pH 7.4）购自Sigma-Aldrich（德国）。醋酸锌二水合物购自Polskie Odczynniki Chemiczne S.A.（波兰）。氢氧化钠片剂、绝对乙醇和甲醇由Fisher Chemical（德国）提供。Dulbecco改良鹰血清（DMEM）、灭活胎牛血清（FBS）、抗生素（青霉素100 U/mL,
制备与药物负载
载体与药物的重量比、温度、负载时间、溶剂类型及其他工艺条件均会影响药物负载效率。在本研究中，优化仅限于药物与载体的重量比，因为该参数决定了可用于负载的药物相对量，允许系统性地考察其对负载能力的影响，同时减少实验变量的数量。温度、溶剂类型和孵育时间均保持恒定。
结论
总之，我们证明石墨氮化碳（g-C?N?）、ZnO/g-C?N?、负载小檗碱的g-C?N?（BER@g-C?N?）和负载小檗碱的ZnO/g-C?N?（BER@ZnO/g-C?N?）纳米复合材料通过聚缩合和溶剂辅助吸附法成功制备，且小檗碱药物有效地负载到了复合材料中。基于整体配方性能，BER@g-C?N?选择了80:20的载体与药物重量比。相比之下，BER@ZnO/g-C?N?选择了60:40的比例。
CRediT作者贡献声明
Marwa Y. Kenawy：写作 – 审阅与编辑、写作 – 初稿、监督、方法论、数据整理、概念构思。Mennatt Allah H. Attia：写作 – 初稿、监督、方法论、数据整理。Mazen Sherif：写作 – 初稿、方法论、数据整理。Doaa A. Ghareeb：写作 – 初稿、监督、方法论、数据整理。Hesham M.A. Soliman：写作 – 初稿、监督、方法论、数据整理。Mariam Sh. Gohr：写作 – 审阅与编辑。
Marwa Y. Kenawy|Mennatt Allah H. Attia|Mazen Sherif|Doaa A. Ghareeb|Hesham M.A. Soliman|Mariam Sh. Gohr
