《ACS Applied Bio Materials》：Comparison of Antifungal Efficacy of Biosynthesized versus Chemically Synthesized Silver Nanoparticles against Candida Species: Phytochemical Surface Chemistry at the Nano-Fungal Biointerface
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研究人员报道了一种利用法戈尼亚羊角芹（Fagonia indica）水提物进行一步生物合成银纳米粒子（Fa-AgNPs）的方法，并在纳米-真菌生物界面上以白色念珠菌（Candida albicans）和新出现的多重耐药病原体耳念珠菌（Candida auris
研究人员报道了一种利用法戈尼亚羊角芹（Fagonia indica）水提物进行一步生物合成银纳米粒子（Fa-AgNPs）的方法，并在纳米-真菌生物界面上以白色念珠菌（Candida albicans）和新出现的多重耐药病原体耳念珠菌（Candida auris）为靶标，对其活性进行了基准评价。Fa-AgNPs呈多分散性和准球形，其平均直径小于柠檬酸盐包被的化学合成银纳米粒子（Cs-AgNPs）（19.41 ± 7.32 nm vs 29.01 ± 2.63 nm）。Fa-AgNPs对两种菌种的抗真菌性能均优于Cs-AgNPs，对白色念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为31.25 vs 125 μg/mL，对耐唑类药物的耳念珠菌则分别为3.91 vs 7.81 μg/mL。针对耳念珠菌，Fa-AgNPs的效力比氟康唑（fluconazole）至少高出64倍（3.91 vs >250 μg/mL）。据研究人员所知，这是首次报道法戈尼亚羊角芹介导的AgNPs对该病原体的MIC低于4 μg/mL。在机制上，Fa-AgNPs延迟了生长起始时间，提高了白色念珠菌的胞内活性氧（ROS）水平，并在两种菌种中诱导了基于过氧化氢酶的抗氧化防御；扫描电子显微镜（SEM）显示两种菌种均出现出芽细胞和胞外聚合物（EPS）的丢失，表面由光滑转变为粗糙，并出现细胞壁损伤，这与主要以氧化性界面机制一致。溶血试验表明，在最低测试浓度（2.5 μg/mL）下具有可接受的血液相容性，而在更高浓度下溶血率增加。
**论文解读：植物化学表面化学调控的生物合成银纳米粒子对念珠菌属真菌的抗真菌增效机制**
**一、研究背景与问题**
侵袭性真菌感染已成为全球范围内日益严峻的公共卫生危机，每年约导致380万人死亡，其中约250万例直接归因于真菌感染本身，而某种形式的真菌病每年影响约10亿人。在每年4890万脓毒症病例中，相当大比例由真菌病原体引起，且这些感染使病死率几乎翻倍。在医院环境中，念珠菌属是血流感染的主要病原体之一：念珠菌血症和侵袭性念珠菌病合计每年约157万例，约99.5万人死亡，粗死亡率接近64%。其中白色念珠菌和多重耐药（MDR）的耳念珠菌是主要致病菌种。住院患者因广谱抗菌药物的过度使用、实体器官移植、中性粒细胞减少症及重症监护时间延长等因素，获得性真菌感染风险显著升高。及时有效的治疗至关重要，因为有效抗真菌治疗每延迟一小时，脓毒症患者的生存率均会出现可测量的下降。
然而，目前临床可用的系统性抗真菌药物仅有四类——唑类、棘白菌素类、多烯类和嘧啶类似物（如氟胞嘧啶）——且各类药物均已有耐药性丧失的报道。氟康唑等唑类药物仍是真菌感染的一线治疗药物，但随着耐药菌株的出现，此类药物的可靠性正在下降。鉴于当前抗菌药物耐药性的发展趋势以及真菌感染发病率的上升，临床上迫切需要具有独特作用机制、广谱且有效的抗真菌药物。
金属基纳米材料，特别是银纳米粒子（AgNPs），已成为具有广谱抗菌活性的强效抗菌剂，能够破坏生物被膜、通透化细胞膜并产生致死性活性氧（ROS）。然而，传统化学或物理合成AgNPs的方法依赖高能耗工艺和有毒的还原剂或封端剂，限制了其生物医学转化。相比之下，利用植物提取物作为双重还原剂和稳定剂的绿色合成路线提供了一种可规模化、低能耗、环境友好的替代方案，且由于表面结合的植物化学物质，往往能获得具有增强生物活性的AgNPs。AgNPs的活性最终取决于纳米-生物界面（nano-biointerface）上发生的事件，即纳米粒子表面与微生物细胞被膜之间的物理化学接触。封端化学决定了胶体稳定性、表面电荷以及递送至靶细胞的离子和活性物种的局部浓度。柠檬酸盐包被的AgNPs呈现化学组成简单、静电稳定的表面，而植物化学物质封端的绿色AgNPs则修饰有类黄酮、酚类、萜类等具有自身氧化还原活性和结合亲和力的小分子。将这两种表面化学体系针对相同的真菌靶标进行比较，可以在评估粒径效应的同时，解析生物界面对抗真菌效力的贡献。
法戈尼亚羊角芹（Zygophyllaceae科）是一种药用灌木，在传统医学中用于治疗从发热、哮喘到肾脏和肿瘤疾病等多种疾病。其丰富的类黄酮、生物碱、皂苷和萜类化合物组成使其提取物成为纳米粒子绿色合成中很有前景的还原剂和封端剂。尽管已有研究显示法戈尼亚羊角芹提取物具有抗真菌或抗癌活性，但据研究人员所知，法戈尼亚羊角芹介导的AgNPs尚未针对临床相关的念珠菌病原体进行评估。
**二、研究内容**
研究人员报道了一种利用法戈尼亚羊角芹水提物一步绿色合成多分散性、平均尺寸约19 nm的银纳米粒子（Fa-AgNPs）的方法，并对其进行了结构表征。研究人员将绿色合成的Fa-AgNPs、柠檬酸盐包被的化学合成AgNPs（Cs-AgNPs）以及一线唑类药物氟康唑对白色念珠菌和耳念珠菌的抗真菌效力进行了比较。研究人员表征了生长抑制动力学，并考察了候选作用机制，包括细胞表面损伤、胞内ROS生成和抗氧化酶的诱导。两种纳米粒子均通过溶血试验评估了血液相容性。通过将绿色合成纳米制造与靶向微生物学评价相结合，该研究评估了植物化学物质封端的AgNPs是否比柠檬酸盐封端的对应物对耐唑类念珠菌具有优势。
**三、主要关键技术方法**
该研究采用多种核心表征与生物学评价技术。物理化学表征方面，使用透射电子显微镜（TEM）结合能量色散X射线光谱（EDS）测定Fa-AgNPs的核心尺寸、形貌和元素组成，并利用ImageJ软件统计约100个粒子的尺寸分布；动态光散射（DLS）和zeta电位测定在水性分散体系中评估水合粒径和表面电荷；紫外-可见（UV-Vis）光谱用于确认表面等离子体共振（SPR）特征吸收峰。抗真菌活性评价方面，采用纸片扩散法初步筛选抑菌圈，并通过肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。机制研究方面，使用H2DCFDA荧光探针定量胞内ROS，采用Amplex Red过氧化氢酶活性检测试剂盒评估抗氧化酶诱导，利用扫描电子显微镜（SEM）观察纳米粒子-真菌相互作用的超微结构变化。血液相容性通过溶血试验评估。所用人红细胞来自一名健康成年志愿者（已获得书面知情同意）；耳念珠菌分离株AR-0385（CDC & FDA Antimicrobial Resistance Isolate Bank，属clade IV，含ERG11 Y132F突变）和白色念珠菌ATCC 90028为模式菌株。统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后多重比较。
**四、研究结果**
**4.1 纳米粒子的表征与比较**
两种纳米粒子在尺寸分布、表面电荷和封端化学方面存在差异。UV-Vis结果显示，Fa-AgNPs在SPR范围内呈现更宽的吸收光谱，峰值在λmax = 430 nm，而Cs-AgNPs光谱较窄，峰值在λmax = 400 nm。Fa-AgNPs更宽且红移的SPR与其异质性尺寸群体、植物化学冠层的介电影响以及粒子间一定程度的耦合一致。TEM显微照片显示，Fa-AgNPs呈多分散性和准球形，平均粒径为19.41 ± 7.32 nm（CV = 37.7%；粒径范围5.24–42.72 nm；TEM衍生比表面积（SSA）= 29.5 m2/g），而Cs-AgNPs为29.01 ± 2.63 nm（CV = 9.1%；基本均匀；SSA = 19.7 m2/g）。DLS测得Fa-AgNPs的水合直径约为116.96 nm，Cs-AgNPs约为34 nm，这与生物合成粒子表面结合了植物化学物质层一致。Fa-AgNPs的zeta电位为–21.73 mV，Cs-AgNPs为–50 mV，表明Cs-AgNPs携带显著更高的表面电荷；Fa-AgNPs的zeta电位低于常规±30 mV静电稳定阈值，与DLS推断的部分团聚一致。
**4.2 纳米粒子的抗真菌活性**
纸片扩散法测定结果表明，生物合成的Fa-AgNPs对白色念珠菌产生14.1 ± 0.4 mm的抑菌圈，对耳念珠菌产生16.6 ± 1.1 mm的抑菌圈。Cs-AgNPs活性较低，分别产生9.5 ± 0.2 mm和10.5 ± 0.3 mm的抑菌圈。氟康唑对白色念珠菌表现出最强的抗真菌活性（29.4 ± 1.4 mm），但对耳念珠菌无活性，与该菌对氟康唑耐药的表型一致。
**4.3 纳米粒子的最低抑菌浓度**
微量稀释法测定结果显示，植物提取物在高达250 μg/mL的浓度下对两种菌种均无抗真菌活性，而Fa-AgNPs具有活性，对白色念珠菌的MIC为31.25 μg/mL，对耳念珠菌的MIC为3.906 μg/mL。Cs-AgNPs对白色念珠菌的效力较低（MIC = 125 μg/mL），但对耳念珠菌活性相当（MIC = 7.8125 μg/mL）。一线唑类药物氟康唑对白色念珠菌表现出强抗真菌活性（MIC = 3.906 μg/mL），但对耳念珠菌无效（MIC > 250 μg/mL）。
**4.4 时间依赖性差异生长抑制**
36小时生长动力学监测显示，在白色念珠菌中，Fa-AgNPs将指数生长期起始时间延迟至约19小时，Cs-AgNPs延迟约3小时至约12小时，未处理对照在约9小时进入指数期。两种纳米粒子处理均仅影响生长起始：指数期开始后，最大光密度和平均生长速率均未相对于未处理对照降低。在耳念珠菌中，Cs-AgNPs将滞后期相对于对照移动约3小时，而氟康唑未产生可测量的滞后期变化。相比之下，Fa-AgNPs处理产生最强的抑制作用，约20小时无 measurable 生长（滞后期20:31 ± 00:49），最大光密度比对照低约20%（1.42 ± 0.07 vs 1.81 ± 0.29）。最值得注意的是，Fa-AgNPs处理耳念珠菌在所有处理中产生了最大的生长抑制，将滞后期延长至约20小时。
**4.5 活性氧定量**
H2DCFDA荧光探针检测结果表明，不同处理产生了不同水平的ROS。在白色念珠菌中，Fa-AgNPs在0.5 × MIC（MIC = 31.25 μg/mL）下在所有处理中数值上产生了最高的ROS信号，两种纳米粒子类型之间的成对比较是唯一具有统计学显著性的对比（P = 0.0128）。Cs-AgNPs在0.5 × MIC（MIC = 125 μg/mL）下表现出最低的ROS产量，尽管其绝对浓度是Fa-AgNPs组的四倍（62.5 vs 15.6 μg/mL）。Fa-AgNPs在两种菌种中均比Cs-AgNPs产生更高的ROS读数；但在耳念珠菌中，所有处理均低于H?O?阳性对照基准，且氟康唑给出的DCF信号高于任一纳米粒子，这与该菌种中DCF滞留反映外排能力以及氧化剂负荷一致。这些结果表明氧化应激是Fa-AgNPs抗真菌作用的贡献因素之一，尤其针对白色念珠菌。
**4.6 过氧化氢酶活性测定**
Amplex Red过氧化氢酶活性检测结果显示，Fa-AgNPs在白色念珠菌和耳念珠菌中均诱导了最高的过氧化氢酶活性。氟康唑在两种菌种中引发的过氧化氢酶响应均低于Fa-AgNPs。在两种菌种中，Fa-AgNPs诱导的过氧化氢酶活性均显著高于氟康唑和Cs-AgNPs（p < 0.05），表明念珠菌属对每种处理均产生显著的抗氧化响应。结合纸片扩散、生长动力学、MIC和ROS结果，这些数据表明Fa-AgNPs比柠檬酸盐封端的粒子或唑类药物更能强烈地激发真菌的氧化应激响应。
**4.7 纳米粒子-真菌相互作用**
SEM成像显示，未经处理的白色念珠菌和耳念珠菌细胞呈密集堆积、边界清晰的卵圆形，表面光滑，存在大量出芽细胞和丰富的胞外聚合物（EPS）。经Fa-AgNPs或Cs-AgNPs处理后，两种菌种均表现出细胞密度降低、出芽细胞减少以及EPS丢失。真菌表面外观从光滑转变为粗糙，并出现明显的细胞壁损伤迹象。氟康唑处理的细胞在两种菌种中均基本保持光滑表面和完整的卵圆形形态，与其靶向胞内麦角固醇合成途径而非作用于细胞被膜的作用机制一致。
**4.8 纳米粒子的细胞毒性研究**
溶血试验结果表明，在最低测试浓度（2.5 μg/mL）下，Fa-AgNPs和Cs-AgNPs的溶血百分比均低于5%，该浓度接近Fa-AgNPs对耳念珠菌的MIC（3.906 μg/mL），但低于Cs-AgNPs的MIC（7.8125 μg/mL），且远低于两种纳米粒子对白色念珠菌的MIC。这表明在2.5 μg/mL浓度下，两种纳米粒子在ASTM F756/ISO 10993-4标准下至多呈轻微溶血，但在更高浓度下溶血增加。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，Fa-AgNPs相较于Cs-AgNPs的效力优势应在纳米-真菌生物界面层面理解。两种材料在核心尺寸和比表面积上存在差异（19.41 vs 29.01 nm；29.5 vs 19.7 m2/g），封端化学也不同。较小的AgNPs已知具有更强的抗菌活性，因为它们释放更多Ag?并更容易进入细胞。Fa-AgNPs的水合直径（116.96 nm）超过其TEM核心尺寸（19.41 nm），zeta电位较化学合成粒子负值更小（–21.73 mV vs –50 mV），两者均与表面结合的植物化学冠层一致。植物提取物本身在高达250 μg/mL的浓度下对两种酵母均无活性，表明植物化学物质在此剂量下本身不具备抗真菌活性，而是通过纳米粒子表面发挥作用。因此，效力增强归因于较小的粒径和Fa-AgNPs所携带的植物化学表面化学的共同作用。
SEM成像观察到的出芽细胞和EPS丢失、表面粗糙化和细胞壁损伤，结合白色念珠菌中胞内ROS升高和两种菌种中过氧化氢酶抗氧化防御的诱导，提示一种以局部氧化化学为主导的界面机制，而非机械破坏。研究将两种纳米粒子系统的差异归因于其表面化学：柠檬酸盐仅提供静电稳定化，留下化学惰性的界面，而富含氧化还原活性类黄酮和酚类的法戈尼亚羊角芹植物化学冠层构成了一个活性生物界面，既能穿梭Ag?释放，又能在与真菌被膜接触点贡献自身的氧化负荷。这种界面化学也可能解释对耳念珠菌观察到的更强效力，因为其细胞壁组成与白色念珠菌不同，呈现出与植物化学装饰表面和柠檬酸盐包被表面可能不同地相互作用的独特生物界面。
研究局限性包括：仅测试了每个菌种的一个分离株，每次测定重复三次，终点报告的是抑制而非杀死；由于Fa-AgNPs和Cs-AgNPs在封端化学和尺寸上均不同，两个变量的各自贡献无法分离。
研究结论指出，在本研究中，与化学合成的Cs-AgNPs相比，生物合成的Fa-AgNPs对白色念珠菌和耳念珠菌均表现出更优的抗真菌活性，证据为更低的MIC值、更大的抑菌圈以及生长动力学测定中更长的滞后期延长。尽管氟康唑对白色念珠菌的活性优于两种纳米粒子，但该药对耳念珠菌无效（MIC > 250 μg/mL），这凸显了Fa-AgNPs对耐唑类菌株的临床实用性。基于SEM、ROS测定和过氧化氢酶活性测定的机制分析表明，Fa-AgNPs主要通过细胞表面的氧化应激发挥作用，伴随细胞壁损伤，靶向规避常规唑类耐药的途径。其改善的效力归因于减小粒径与法戈尼亚羊角芹类黄酮、酚类和萜类植物化学冠层的组合，这是柠檬酸盐包被的Cs-AgNPs所缺乏的特征。总体而言，这些发现将Fa-AgNPs定位为一种绿色合成的生物界面平台，其植物化学表面化学驱动了对多重耐药念珠菌属物种的效力，在最低测试浓度下具有可接受的红细胞相容性，并支持未来对生物被膜活性、体内药代动力学、生物相容性以及与现有抗真菌疗法协同作用的研究。该论文发表在《ACS Applied Bio Materials》。
