《ACS Omega》：UbC4 from Leishmania is a Druggable E2 Ubiquitin Conjugating Enzyme: Structural Basis and Fragment Hits for Future E2-Recruiting PROTAC Development
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利什曼病是一种被忽视疾病，每年影响约两百万人。当前治疗常具有高毒性或易产生耐药性，因此亟需新治疗策略。PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）或可同时缓解毒性和耐药问题。然而，利什曼原虫中泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin–Proteasome System，U
利什曼病是一种被忽视疾病，每年影响约两百万人。当前治疗常具有高毒性或易产生耐药性，因此亟需新治疗策略。PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）或可同时缓解毒性和耐药问题。然而，利什曼原虫中泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin–Proteasome System，UPS）研究很少；仅鉴定出两个含CULT结构域的E3连接酶，且没有携带von Hippel–Lindau（VHL）结构域的经典E3。研究人员提出，在该生物中可不直接利用E3，而是利用UbC4这一E2酶来开发能够结合目标蛋白的PROTAC。研究人员对利什曼原虫 major 的泛素结合酶4（UbC4）进行了生化和结构表征；通过片段筛选发现10个结合UbC4不同空腔的片段，其中5个结合在人类中保守性较差的同一非催化口袋，1个片段结合在催化半胱氨酸附近。研究人员利用DeepFrag预测和分子对接探索片段延伸策略，以提高其对相应结合位点的亲和力，从而为开发用于利什曼病治疗的E2招募PROTAC或UPS抑制剂提供指导。
《ACS Omega》发表的该论文以利什曼原虫泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin–Proteasome System，UPS）为对象，针对现有抗利什曼病药物毒性高、易耐药、机制不清等问题，提出绕过经典E3连接酶、直接利用E2酶UbC4开发E2招募PROTAC的新思路。研究背景方面，利什曼病每年新发数十万至百万例，内脏利什曼病可致死；现有药物如两性霉素B、锑剂、米替福新等疗效和安全性有限。UPS在寄生原生动物生命周期调控中十分关键，但利什曼原虫UPS结构数据匮乏，且缺乏人类PROTAC常用的VHL类E3，因此难以按常规PROTAC路径设计。研究人员由此表征利什曼 major UbC4（人源同源为UbE2H），并寻找可用于PROTAC招募配体的口袋。
关键技术方法上，研究人员使用利什曼 infantum 的UbA1a（E1）、利什曼 major 的UbC4（E2）和利什曼 infantum 的Ub（泛素）重组蛋白体系；采用非还原SDS-PAGE与Western blot证明UbC4-Ub硫酯形成；通过X射线晶体学解析UbC4结构并用CastPFold进行空腔分析；在Diamond Light Source XCHEM设施用DSi-Poised库开展晶体浸泡片段筛选，以PanDDA识别hit；再用DeepFrag进行片段生长预测，并用AutoDock Vina进行分子对接。
UbC4 Construct
研究人员采用截除C端67残基的LmUbC4构建体，因为全长蛋白形成包涵体，且AlphaFold2预测C端为无序区；LmUbC4与L. infantum UbC4序列一致性98.2%，说明结论可外推至引起内脏利什曼病的虫种。
UbC4 Forms Thioester Complexes with Ub In vitro
通过UbA1a、UbC4、Ub和ATP反应，非还原SDS-PAGE与Western blot显示单泛素化UbC4、二泛素及多泛素化物种；缺UbA1a或ATP时无泛素化条带，证明该过程依赖E1激活和ATP，支持LmUbC4在UPS中的功能角色。
UbC4 Displays the Canonical E2 Ubiquitin-Conjugating Enzyme Fold
研究人员解析2.16 ?结构，UbC4具有典型Ubc折叠：6个α螺旋、1个310螺旋和4条β链；催化半胱氨酸为Cys93，周围有HPN三联体（His82、Pro83、Asn84）。空腔分析显示cavity 3为非催化口袋，在人中部分保守而在利什曼属中保守，且远离E1/E3/Ub作用面，适合作为PROTAC招募位点。
Fragments Were Identified in Different Cavities of UbC4
晶体片段筛选得到10个片段；cavity 3中最集中，片段331、360、466、637、733共有“芳香/杂芳香基团锚定＋酰胺/磺酰胺链接＋Asp144氢键”的结合指纹；fragment 274结合含催化Cys93的cavity 15，可作为抑制Ub转移起点；部分cavity 2/14片段受晶格对称接触影响，需谨慎看待。
Structure-Guided Fragment Elongation
研究人员以cavity 3片段和cavity 15片段为起点用DeepFrag延伸，再用Vina对接。fragment 733衍生物CE074结合能改善约1.5 kcal/mol，可与His82、Arg120形成新静电作用；360、637衍生物仅有小幅改善。说明从低亲和片段向高亲和配体生长具备结构依据。
讨论与结论部分总结：研究人员指出，利什曼原虫UPS缺乏可用经典E3，使E2直接招募成为有吸引力的替代策略。UbC4结构表征与片段筛选提供了首个利什曼E2可药性地图：cavity 3是选择性E2招募PROTAC口袋，cavity 15可作抑制剂口袋。DeepFrag与对接不是实验验证，但能指导后续类似trypanothione reductase（TR，锥虫硫醇还原酶）难成药靶点的PROTAC设计。该研究意义在于填补利什曼UPS结构空白，为选择性抗寄生虫PROTAC和UPS抑制剂提供起点。
研究结论译为：利什曼原虫UbC4是具有可药性的E2泛素结合酶；研究人员通过结构与片段筛选鉴定出位于非保守cavity 3的PROTAC招募起点，以及位于催化区cavity 15的抑制剂起点。基于DeepFrag的片段延伸和分子对接显示，cavity 3片段可经合理生长提高亲和力与种间选择性。该工作为面向利什曼病的E2招募PROTAC和UPS抑制剂开发建立了结构基础与先导片段。
