热处理对Melipona bicolor (Lepeletier, 1836)蜂蜜长期储存的影响

《ACS Food Science & Technology》：Influence of Heat Treatment on Melipona bicolor (Lepeletier, 1836) Honey in Long Term Storage

　　

本研究旨在评估Melipona bicolor蜂蜜在两年内储存期间的理化与微生物状况，比较原料蜂蜜与热处理（TT）样品，并探究各参数间的相关性。TT样品按当地做法经65 °C处理3分钟。样品每60天检测一次，持续12个月，并在储存满24个月后再次检测。原料蜂蜜在颜色变深、水分活度、蔗糖、羟甲基糠醛（HMF）以及酵母和霉菌计数方面变化显著，同时总糖和还原糖、乳酸菌及中温需氧菌数量下降。TT蜂蜜呈现类似变化，但蔗糖、水分活度和HMF除外。两种处理在水分、还原糖、蔗糖、灰分、HMF和酵母计数方面均超出法定限量。一个有趣的观察是，酵母生长仅与Starmerella sp.属相关，并与水分活度和水分呈正相关，进一步证实该蜂蜜易发生自然发酵。鉴于蔗糖和HMF在州法规中设有最高限量，HMF是蜂蜜安全的关键指标，而水分活度与微生物生长直接相关，这些参数未发生显著变化表明TT在评估条件下更为有效。酵母增殖超出法定限量，这自然与蜜蜂行为相关，应评估其健康风险，并考虑调整法规以反映无刺蜂蜂蜜区别于Apis mellifera蜂蜜的特性。

**热处理对Melipona bicolor蜂蜜长期储存品质影响的综合解读**

无刺蜂（stingless bees, SBs）广泛分布于热带和亚热带地区，其蜂蜜（SBH）因高水分含量、高水分活度以及较高的酵母和霉菌数量而极易在储存中自然发酵。与西方蜜蜂（Apis mellifera）蜂蜜相比，SBH产量小、口感酸甜、质地稀薄，但市场价格更高。巴西虽已有部分州制定了相关法规，但尚不足以涵盖该国超过300种无刺蜂所产蜂蜜的多样性。热处理（如巴氏灭菌）常用于延长蜂蜜货架期，但针对SBH加热影响的研究依然有限，尤其缺乏长期储存的评估。Melipona bicolor（Guaraipo）是巴拉那州蜂农常用的产蜜物种，年产仅0.5至1升，且被列为濒危物种。该州农业防御机构（ADAPAR）制定了SBH加工和消费的理化与微生物标准。鉴于M. bicolor蜂蜜的高水分和易发酵问题，研究人员开展了一项为期两年的长期监测，旨在评估热处理（TT）与储存对其理化和微生物特性的影响。

研究人员从巴西南部巴拉那州大西洋森林生物群落内的Mandirituba和Fazenda Rio Grande三处无刺蜂养殖场采集三份M. bicolor蜂蜜，每份约1 kg，冷藏一个月模拟蜂农常见操作。随后将蜂蜜分为未处理（原料）和热处理（65 °C，3 min）两组，每组三个样品，在室温（约25 °C）见光条件下储存两年。在储存后第1、3、5、7、9、11、13和24个月（即T1至T8）定期取样，进行理化和微生物指标检测。研究得出以下主要结论：原料蜂蜜在水分活度、蔗糖和羟甲基糠醛（HMF）等参数上随储存时间显著增加，而TT蜂蜜在这些指标上无显著变化，表明TT处理在控制关键安全指标方面更为有效；然而两种处理在储存后期均出现多项指标超出州立法限量，特别是酵母计数在很早就已超标。通过DNA测序，研究人员将蜂蜜中检出的酵母初步归为Starmerella属，该属酵母与无刺蜂及其底物密切相关，其增殖与水分活度和水分呈正相关，印证了SBH易发生自然发酵的特性。该研究为理解热处理对SBH长期储存品质的影响提供了首个系统性的数据，也为法规是否需要针对无刺蜂蜂蜜特性进行调整提供了科学依据。论文发表在《ACS Food Science 》。

在技术方法方面，样本采集自上述巴西南部巴拉那州三处蜂场（Mandirituba两处，Fazenda Rio Grande一处），共约3 kg蜂蜜，于2022年3月收集。理化检测包括：分光光度法测定颜色（Pfund标度）、水活度仪测定水分活度（a_w）、阿贝折光仪测定水分和可溶性固形物（°Brix）、Lane & Eynon滴定法测定总糖、还原糖和蔗糖、pH计和滴定法测定酸度、马弗炉测定灰分、高效液相色谱（HPLC）测定HMF。微生物检测包括：最大可能数（MPN）法测定35 °C和45 °C大肠菌群、芽孢菌培养、沙门氏菌增菌和分离、MRS琼脂计数乳酸菌（LAB）、平板计数琼脂计数中温需氧菌、PDA培养基计数酵母和霉菌；对酵母扩增ITS区并进行Sanger测序以初步鉴定属。统计方法采用Shapiro–Wilk检验、Kruskal–Wallis检验、Dunn检验、Mann–Whitney检验和Spearman相关分析。

**3.1. 理化特性**（原文：Physical-Chemical Characteristics）。颜色方面，两种处理的蜂蜜在储存期间均逐渐变深，与储存时间呈中等正相关（ρ = 0.397），且处理间无显著差异；按ADAPAR标准，原料和TT蜂蜜的颜色在T7时仅TT不合格，至T8时两者均不合格。水分活度方面，原料蜂蜜随储存时间显著升高（从0.78升至0.79–0.84），而TT蜂蜜无显著变化，但两种处理间在任一储存时间点均无显著差异。水分方面，原料和TT蜂蜜之间无显著差异，但原料蜂蜜在T5开始超过35%的法定上限，TT蜂蜜从T6起超标，且水分与储存时间呈正相关（ρ = 0.561）。可溶性固形物（°Brix）在整个储存期内无显著变化，且与水分呈强负相关（ρ = ?0.999）。总糖和还原糖在两种处理中均随时间显著下降，反映出微生物的消耗；原料蜂蜜在T6时还原糖低于最低限量（47 g 100 g^–1），TT蜂蜜在T7时低于该限量。蔗糖仅在原料蜂蜜中显著增加，并与储存时间呈强正相关（ρ = 0.662），与水分也正相关（ρ = 0.565），两种处理在T3后均不符合不超过5 g 100 g^–1的限量。游离酸度在原料蜂蜜中始终高于TT蜂蜜，在T3和T6时差异显著，但两者均低于60 mequiv kg^–1的限值。pH随时间下降（ρ = ?0.610），最终两种蜂蜜均为2.69，低于4.7的限值。灰分仅在T8时两种蜂蜜均超过0.8 g 100 g^–1的限量，且处理间无差异。HMF方面，原料蜂蜜在T7和T8显著升高，而TT蜂蜜无显著变化；但两种蜂蜜在T8时均超过40 mg kg^–1的法定上限。

**3.2. 微生物参数**（原文：Microbiological Parameters）。所有样品均未检出35 °C和45 °C大肠菌群、芽孢菌和沙门氏菌。乳酸菌（LAB）仅在T2时检出，且原料与TT蜂蜜之间存在显著差异，此后未再检出，其存活可能与冷藏和长期储存有关。中温需氧菌在两种处理中随时间显著下降，但在T3后不再检出，其消失与水分活度和水分呈负相关。霉菌未检出，酵母持续生长并成为主要微生物。在T2时，两种蜂蜜的酵母计数均已超过州法规限值（4.00 log cfu mL^–1），且储存期内持续超标。对酵母的ITS区测序初步鉴定为Starmerella属，该属与无刺蜂自然生态密切相关。酵母计数与水分活度（ρ = 0.51）和水分（ρ = 0.38）呈正相关，表明高水分环境促进了酵母增殖。

讨论部分指出，TT蜂蜜在蔗糖、水分活度和HMF这三个关键指标上未出现显著变化，而原料蜂蜜则明显变化，因此TT处理在延长M. bicolor蜂蜜储存稳定性方面更为有效。酵母超标是自然现象，与蜜蜂采蜜行为直接相关，后续需要评估其对人类健康的风险，并考虑调整相关法规，以区别于西方蜜蜂蜂蜜的标准。研究结论如下：本研究首次全面评估了原料和热处理M. bicolor蜂蜜在室温下储存两年的理化和微生物变化。鉴于蔗糖和HMF在州立法中设有限值，HMF是蜂蜜安全的关键指标，水分活度直接关联微生物生长，这些参数在TT蜂蜜中未发生显著变化，表明热处理在评估条件下更为有效。酵母生长仅与Starmerella属相关，且与水分活度和水分呈正相关，进一步证实了SBH易自然发酵的特性。酵母计数超过法定限值这一现象与无刺蜂的自然行为紧密相关；应审慎评估这些变化是否对人类健康构成风险，或是否应为这类蜂蜜制定专门的监管框架，认可其与Apis mellifera蜂蜜不同的特性。