《ACS Omega》：Identification of the Acetamide-Chalcone Derivative That Selectively Inhibits ABCG2 Transport Activity
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多药耐药（MDR）仍是癌症化疗有效性的主要障碍，其通常由ABCG2等ABC转运蛋白的过表达所驱动。在本研究中，研究人员鉴定出合成查尔酮衍生物B5为一种选择性ABCG2抑制剂。在评估的20种查尔酮类似物中，B5在R1位含有乙酰胺基团、在R2位含有乙氧基取代基，是
多药耐药（MDR）仍是癌症化疗有效性的主要障碍，其通常由ABCG2等ABC转运蛋白的过表达所驱动。在本研究中，研究人员鉴定出合成查尔酮衍生物B5为一种选择性ABCG2抑制剂。在评估的20种查尔酮类似物中，B5在R1位含有乙酰胺基团、在R2位含有乙氧基取代基，是唯一在10 μM浓度下对ABCG2介导的Hoechst 33342转运产生超过50%抑制的化合物，同时其对ABCB1无抑制活性。B5对ABCG2抑制的IC50为2.7 μM，与已报道的查尔酮类ABCG2调节剂的低微摩尔效价一致。此外，B5在过表达ABCG2的细胞中有效逆转了ABCG2介导的化疗药物SN-38耐药性，从而恢复了药物敏感性。值得注意的是，B5在高达5 μM的浓度下无细胞毒性，且在亲本细胞与过表达ABCG2的细胞之间未表现出差异性细胞毒性，提示其在实验条件下未被高效转运。ATP酶实验显示，B5刺激而非抑制ABCG2 ATP酶活性，这一行为此前已在化学结构不同的ABCG2抑制剂中有所报道。分子对接和分子动力学模拟表明，B5结合于ABCG2的中心抑制剂结合腔内，与Phe439形成π–π相互作用，并与Val546形成疏水接触，尽管其相互作用频率低于参考抑制剂Ko143。这种结合模式连同B5的理化性质提示，供电子乙酰胺基团增强了其抑制活性，可能通过促进结合口袋内的氢键相互作用实现。综上所述，这些发现将B5确定为开发选择性ABCG2抑制剂的有前景的先导化合物，并为合理设计能够克服癌症MDR的更有效类似物提供了结构见解。
**论文解读：选择性ABCG2抑制剂乙酰胺-查尔酮衍生物B5的鉴定与机制研究**
**研究背景与目的**
多药耐药（multidrug resistance, MDR）是癌症化疗面临的主要障碍，其重要机制之一是ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白的过表达，这类蛋白能主动将化疗药物泵出细胞，降低胞内药物浓度，从而导致治疗失败。ABCG2（又称乳腺癌耐药蛋白，breast cancer resistance protein, BCRP）是其中备受关注的成员之一。尽管已有大量不同化学骨架的化合物被研究作为ABCG2抑制剂，但由于选择性不足、毒性、药代动力学特性不佳及临床疗效有限等原因，目前尚无专门用于逆转ABCG2介导MDR的药物获得临床批准。因此，寻找化学上易于获取且结构可修饰的ABCG2抑制剂仍是研究重点。
查尔酮（chalcone）是一类具有两个芳香环的开放链黄酮类化合物，其结构特点使得取代基可独立引入两个芳香环，为结构优化提供了便利。已有研究表明，查尔酮衍生物的ABCG2抑制活性、转运体选择性及固有细胞毒性受环上取代基性质和位置的强烈影响，且相对较小的结构修饰即可显著改变其与ABCG2的相互作用。基于这一结构多样性优势，本研究对一个包含20种查尔酮衍生物的结构明确库进行了功能筛选，以鉴定选择性ABCG2抑制剂并探讨其构效关系。
**研究方案与主要技术方法**
研究人员采用多种实验和计算技术开展了系统研究。首先，利用稳定过表达人ABCG2的HEK293细胞（HEK293-ABCG2）和过表达ABCB1的NIH3T3细胞（NIH3T3-ABCB1），结合流式细胞术，以Hoechst 33342和罗丹明123（rhodamine 123）为荧光底物，对20种查尔酮衍生物进行了ABCG2和ABCB1抑制活性筛选（受试化合物来源为研究者前期合成并报道的化合物库，其中A1–A10含邻溴基、B1–B10含邻乙酰氨基取代）。对筛选得到的最活性化合物B5，进一步测定了浓度-响应曲线以获得半数抑制浓度（IC50），并通过MTT比色法评价其固有细胞毒性及对SN-38和米托蒽醌（mitoxantrone）耐药逆转能力。此外，采用钒酸钠敏感ATP酶活性测定法评价B5对ABCG2 ATP水解活性的影响；利用构象敏感性单克隆抗体5D3结合实验评估B5对ABCG2构象状态的改变。计算方法方面，使用同源建模构建了人ABCG2二聚体结构模型（以PDB 6VXJ为模板并结合AlphaFold补全缺失区域），通过Glide诱导拟合对接（induced-fit docking, IFD）将B5和参考抑制剂Ko143对接至ABCG2中央抑制剂结合腔，随后进行了总时长约1 μs的分子动力学模拟（5次独立200 ns运行），并结合MM/GBSA结合自由能计算分析相互作用模式。此外，还将B5和tariquidar对接至人ABCB1结构（PDB ID: 7A6E）以探究B5对ABCB1无抑制活性的结构基础。
**研究结果**
**查尔酮的合成方案**
本研究所用化合物为Pelosi等人先前报道的溴代和乙酰胺取代查尔酮。这些化合物通过Claisen-Schmidt缩合反应合成，即在碱性条件下芳香醛与酮之间发生缩合形成新的C–C键，生成α,β-不饱和羰基化合物。结构设计上，在酮部分的邻位固定乙酰氨基或溴代基团（A环），与含不同供电子和吸电子基团的取代苯甲醛（B环）反应，获得A1–A10（R1=邻溴）和B1–B10（R1=邻乙酰氨基）共20种衍生物。
**查尔酮抑制剂的ABCG2抑制活性筛选**
在HEK293-ABCG2细胞中，以Ko143为参考抑制剂（定义为100%抑制），分别检测了20种查尔酮衍生物在1 μM和10 μM浓度下对ABCG2介导的Hoechst 33342转运的抑制百分比。结果表明，所有溴代查尔酮（A组）即使在10 μM浓度下也未显著抑制ABCG2活性（A5仅产生24%的弱抑制），说明当R1为邻溴取代时，仅改变R2取代基不足以赋予有效的ABCG2抑制作用。与之形成鲜明对比的是，大多数乙酰氨基查尔酮（B组）在10 μM浓度下表现出了ABCG2抑制活性，部分衍生物抑制率超过40%。其中，R1为乙酰氨基（CH3CONH）、R2为乙氧基（OCH2CH3）的B5表现出最高的抑制活性（10 μM时抑制率为58.4%），且是唯一在10 μM时抑制率超过50%的化合物。而在ABCB1抑制实验中，20种化合物均未对ABCB1介导的罗丹明123转运产生抑制，表明该系列查尔酮衍生物具有ABCG2选择性。构效关系分析表明，R1位取代基的性质是决定抑制活性的关键因素：乙酰氨基作为供电子基团，可能增加查尔酮核心的电子密度，同时其提供的氢键供体（–NH）可与ABCG2结合口袋中的残基形成额外相互作用，从而增强抑制活性；相比之下，溴原子是弱吸电子基团且缺乏氢键形成能力，这可能是A组化合物活性低的主要原因。此外，R2取代基的电子性质和空间特征也影响抑制活性。
**B5对ABCG2介导Hoechst 33342外排的浓度依赖性抑制及对SN-38耐药的逆转**
在HEK293-ABCG2细胞中以Hoechst 33342为底物测定B5的浓度-响应曲线，结果显示B5抑制ABCG2介导外排的IC50为2.70 μM（95%置信区间：1.91–3.81 μM），拟合最大抑制率为88.23%，这与已报道的查尔酮类ABCG2调节剂的低微摩尔效价一致。在耐药逆转实验中，过表达ABCG2的HEK293-ABCG2细胞对SN-38（伊立替康活性代谢物）表现出耐药性，但2.5 μM的B5联合处理可恢复SN-38敏感性至与亲本细胞相当的水平。在肿瘤细胞系H460及其米托蒽醌选择产生的ABCG2过表达亚系H460MX20中，B5同样恢复了细胞对SN-38的敏感性，且对另一种ABCG2底物米托蒽酮也具有化学增敏作用。药物联用分析采用Bliss独立模型计算总体协同评分为10.388，表明B5与SN-38之间存在中等协同作用。此外，B5在高达5 μM浓度下对HEK293和HEK293-ABCG2细胞均无显著细胞毒性，且两种细胞系之间无差异毒性，提示B5未被ABCG2有效转运，符合理想抑制剂的特征。
**B5对5D3抗体结合和ABCG2 ATP酶活性的影响**
钒酸钠敏感ATP酶活性实验显示，参考抑制剂Ko143抑制了ABCG2特异性ATP酶活性，而B5在接近其IC50的浓度（3 μM）以及10倍浓度（30 μM）下，将ABCG2 ATP酶活性刺激至基础水平的大约两倍。这一"刺激ATP酶活性而抑制底物转运"的表型此前在多种化学结构不同的ABCG2抑制剂中也有报道。该现象提示B5可能作为"假底物"——与转运蛋白结合并促进ATP周转，但未被有效转运，从而阻断转运循环。在5D3构象敏感抗体结合实验中，Ko143通常诱导5D3结合增加3至5倍，而B5未改变5D3抗体的结合，表明有效抑制ABCG2介导的转运并不一定需要影响涉及5D3表位的构象变化。
**Ko143和B5存在下ABCG2的分子动力学模拟**
分子对接和分子动力学模拟（5 × 200 ns）结果显示，B5以π-π相互作用与Phe439残基结合（Phe439A相互作用频率为47.3%，Phe439B为11.6%），其R1乙酰氨基部分位于Phe439A和Phe439B附近，第一个芳香环与这些残基的接触距离为3.7 ?和4.1 ?，R2乙氧基朝向Val546A（接触距离约3.5 ?），同时与Val546A和Val546B形成疏水接触。模拟期间B5的结合构象保持稳定（配体RMSD约1–1.5 ?）。参考抑制剂Ko143则优先与A链相互作用，与Phe439A形成距离3.6 ?的π堆积相互作用（频率40.9%），并与Ala397A、Val401A、Val442A和Val442B形成更广泛的疏水相互作用网络。MM/GBSA结合自由能计算结果显示，Ko143的结合稳定性优于B5，这与B5刺激ATPase活性而Ko143抑制该活性的功能差异相符。有意思的是，B5的不对称结合模式和较弱的持续接触可能促使了非生产性催化循环的进行，从而解释了其刺激ATP酶活性的现象。对ABCB1的额外对接分析显示，tariquidar的对接得分（?10.925）优于B5（?7.659），但对接得分仅为比较性预测，不能充分解释功能实验中观察到的ABCB1抑制缺失。
**讨论与结论总结**
本研究通过系统的功能筛选从20种查尔酮衍生物中鉴定出B5为选择性ABCG2抑制剂，其选择性表现、低微摩尔效价、耐药逆转能力及低固有细胞毒性使其成为有前景的先导化合物。构效关系分析强调了R1位乙酰氨基的供电子性质和氢键形成能力对抑制活性的关键贡献。ATP酶刺激和5D3结合阴性等独特表型提示，ABCG2抑制机制并非单一模式。分子模拟为理解B5的结合模式与功能活性之间的关系提供了结构基础。研究结论指出，B5建立了作为选择性ABCG2抑制剂开发的先导化合物地位，其结构见解可为合理设计更有效的、能够克服癌症MDR的查尔酮类似物提供指导。
