《ACS Synthetic Biology》：Platform for Global Profiling of Signal Peptides for Efficient Protein Production
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协调多种分泌蛋白和膜蛋白的表达对细胞构成重大挑战，在哺乳动物表达系统中，新生多肽在内质网（ER）处初始插入分泌途径是主要瓶颈。多种疏水性信号肽以不同效率引导新生多肽进入分泌途径。然而，以蛋白质特异性方式鉴定能够促进高效蛋白质生产的最优信号肽序列仍然是一个
协调多种分泌蛋白和膜蛋白的表达对细胞构成重大挑战，在哺乳动物表达系统中，新生多肽在内质网（ER）处初始插入分泌途径是主要瓶颈。多种疏水性信号肽以不同效率引导新生多肽进入分泌途径。然而，以蛋白质特异性方式鉴定能够促进高效蛋白质生产的最优信号肽序列仍然是一个重大挑战。在此，研究人员提出了一种新平台，用于在哺乳动物细胞中高效高通量鉴定用于分泌蛋白生产的高度优化信号肽。该汇集方法能够同时测试数千种信号肽序列，并鉴定出能够驱动目标蛋白功能性和高效生产的信号肽。研究人员使用不同的生物技术蛋白类别证明了该平台的普遍适用性。由此产生的序列数据与功能知识相结合，可为未来预测高效信号肽的机器学习方法以及从头生成新的合成信号肽以实现蛋白质生物发生的模块化控制提供支撑。
**论文解读**
分泌蛋白和膜蛋白的正确表达对治疗性蛋白生产至关重要。大多数治疗性蛋白（如单克隆抗体、激素和生长因子）在哺乳动物细胞中以分泌蛋白形式生产，其高效表达依赖于新生多肽正确靶向分泌途径以完成折叠、加工和运输。内质网（ER）中的早期生物发生步骤被认为是分泌蛋白生产的主要瓶颈。信号肽（SP）作为N端疏水性肽段，通常由带正电的n区、约7–15个氨基酸的疏水螺旋h区和极性c区组成，以不同效率引导新生多肽进入分泌途径。尽管已知SP选择对蛋白表达具有深远影响，且已有计算和实验方法用于鉴定高效表达驱动信号肽，但系统性鉴定靶蛋白特异性高效SP的经验方法仍较缺乏。为此，研究人员开发了一种新的汇集筛选平台，能够在哺乳动物细胞中高通量鉴定驱动分泌蛋白高效表达的高度优化信号肽，该研究发表于《ACS Synthetic Biology》。
为开展研究，研究人员构建了含N端SP克隆位点及C端GPI锚定基序的慢病毒报告载体，从UniProt收集约3700条天然人和病毒来源的SP序列（含211条非SP阴性对照序列）构成汇集文库，以低感染复数（MOI）转导中国仓鼠卵巢CHO?S细胞，经荧光激活细胞分选（FACS）将细胞分离为高表达群和低表达群，通过下一代测序（NGS）鉴定富集的SP，并利用ExpiCHO和Expi293表达系统进行独立正交验证。
**慢病毒平台用于哺乳动物宿主系统中驱动分泌的信号肽的大规模平行发现**
研究人员设计了含N端SP克隆位点和C端GPI锚定基序的慢病毒表达载体，以胃蛋白酶原II（PgII）为模型蛋白进行功能验证。携带功能性SP的PgII可被靶向至细胞表面并被特异性抗体检测，而无SP的PgII则滞留于胞质并被蛋白酶体降解，证实了该报告系统能够有效区分功能性SP与非功能性SP。
**汇集SP筛选鉴定驱动胃蛋白酶原II细胞表面表达的信号肽**
研究人员将约3700条SP序列的文库克隆入GPI锚定的PgII报告载体，经低MOI慢病毒转导CHO?S细胞后，以FACS将细胞分为高表达群（前5%）和低表达群（其余95%），通过NGS扩增子测序鉴定出在高表达群中显著富集的SP序列。与以往仅能测试数十条序列的哺乳动物SP筛选相比，该平台实现了数千条序列规模的高通量测试，且分选策略更简化。
**PgII SP筛选命中在正交表达系统中的验证**
研究人员选取13条高富集SP和3条低富集SP进行可溶性分泌表达验证。结果显示，13条高富集SP中有9条能检测到PgII表达，其中6条表达水平超过对照SP，而低富集SP均无可检测表达。SP8、SP10和SP13在ExpiCHO和Expi293细胞中均能显著提高PgII分泌表达。在0.5 L规模化培养中，优化SP使纯化蛋白产量提高2.4–4.8倍；尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）分析表明所有SP产生的蛋白均为预期分子量的单体形式；质谱完整分子量分析发现不同SP导致PgII N端出现差异性加工，其中SP13产生异质性较高的N端变体。
**汇集SP筛选鉴定血清淀粉样蛋白A1的表达驱动SP**
研究人员对血清淀粉样蛋白A1（SAA）开展了相同的汇集SP筛选，所有测试的高富集SP均使SAA表达高于对照SP，最优SP使SAA产量从0.37 mg/L提升至1.39 mg/L。值得注意的是，SAA的最优SP序列及其生物物理特征与PgII的完全不同，表明SP对蛋白表达的促进作用具有蛋白特异性。对筛选结果与正交验证表达水平的相关性分析显示两者呈弱至中等相关，与已报道的细菌系统SP筛选研究结论一致。
**讨论与结论**
该研究建立了一种新的汇集筛选策略，可在单个实验中同时测试数千条SP序列，显著加速了高效SP的鉴定进程。对PgII和SAA两种蛋白筛选得到的最优SP序列不同，进一步凸显了蛋白特异性SP鉴定的必要性。PgII的高效SP在仓鼠ExpiCHO和人Expi293细胞中均能促进高效表达，提示最优SP可能也适用于其他哺乳动物细胞系统。不同SP导致的N端加工异质性对于治疗性蛋白生产中的质量控制具有重要参考意义。对已鉴定SP序列的理化性质分析未能发现共同的生物物理参数，提示SP介导的蛋白特异性表达优化机制具有复杂性和多样性。与劳动强度较大的已报道筛选平台相比，该方法更为简便高效，但筛选的可重复性和假阳性率控制仍有待优化。该平台产生的大规模序列数据可为未来机器学习预测和从头设计合成高效信号肽提供数据基础。
