综述：牙髓作为神经血管微环境生物学的高分辨率模型

《Journal of Tissue Engineering》：The dental pulp as a high-resolution model for neurovascular niche biology

　　

摘要：在体外构建功能性组织存在一个共同的瓶颈。现有模型涵盖了血管共同发育、营养性相互作用、血管-神经敏化、屏障功能乃至功能性神经肌肉偶联，但尚无模型重建出功能性神经血管（NV）偶联。研究人员认为，在某一特定维度上，牙髓是解析该偶联最直接的单源底物。单一、临床可获取的神经嵴组织同时提供血管周室以及神经室的胶质与神经营养支持，其体积适合单细胞方法，且在该组织中活动依赖性NV相互作用已在体内可测。这是一项能力声明而非实证演示；尚无体外牙髓模型闭合该回路，可逆性与不可逆性牙髓炎之间的临床分歧仍未解决。本综述明确了牙髓模型可解决的临床、实验及机制性问题，为其他NV偶联组织提供可迁移的方法。

1. 1.
   引言

在完整组织中，神经元与血管并非简单共存，而是相互调控。神经活动动态调节局部血管张力和灌注，灌注及血管来源信号反过来塑造神经元活动与存活，形成构成活动依赖性充血基础的互惠功能回路。研究人员在此使用功能性NV偶联的既定生理学含义，即神经活动与血管张力或血流之间的活动依赖性双向调节，而非组织神经支配与灌注的广义恢复。该偶联是许多组织在体内稳健、可直接测量的属性。在牙髓中，传出方向已有充分文献记载，C纤维激活通过神经肽释放提高牙髓血流量，而血流对感觉神经活动的反向影响虽更具条件性，亦可被证实。

相比之下，在体外重建这种功能性偶联尚未实现。据研究人员所知，尚无工程化或类器官系统再现功能性、双向NV调节回路，即神经活动驱动血管反应、血管或血流信号反馈至神经活动。近期模型所取得的成就最好被解读为一系列日益整合的NV特征的分级序列，但均未闭合该特定回路。类器官超过扩散极限后会出现缺氧、坏死核心。即使引入血管结构，受调控的血流也鲜有跟进。目前已有多种血管化脑类器官系统。在融合的多区域类器官中，内皮旁分泌信号维持后脑而非大脑发育过程中的中间祖细胞。相比之下，从单一胚状体连续共诱导内皮对类器官转录组的影响在血管发育、血管生成和血管新生程序中最为显著，而非神经程序。此外，内皮共培养加速了疾病相关组装体中的星形胶质细胞成熟。然而，血管化脑类器官的单细胞分析显示，缺氧应激仍在周细胞和成纤维细胞上留下最强的转录印记，因为血管存在但其调控缺失。这一模式在各器官中反复出现。肾类器官中的肾小球血管化迄今需要外部施加的流或微环境诱导条件，微流控和基质信号平台分别提供灌注或成熟，而非二者之间的偶联。近期心脏类器官报道在同一构建体中血管丛发育与交感神经支配并存，但血管化与神经支配在其他方面仍是独立的工程轨道。

共同发育与结构共存。人类神经血管共培养现已重现发育性共模式化。通过将分别诱导的血管类器官与脑类器官融合生成的血管化脑类器官，植入后形成稳健的血管网络样结构，神经祖细胞数量增加，并整合小胶质细胞和血脑屏障样结构，支持其用于研究神经血管相互作用。血管通畅性通过加压流体经血管管输送得以证明，但主动灌注并非系统组成部分，作者将其列为下一步工作。此类系统重现NV共同发育，即空间并置及相互营养和旁分泌影响，但神经活动与血管血流之间的功能偶联既非其目标也非已证明的结果。

可灌注3D格式中的双向营养影响。超越静态共培养，可灌注微流控模型已开始捕获双向发育信号。在结合hiPSC来源神经元、内皮细胞和骨髓或脂肪来源壁细胞的长期3D芯片中，神经元网络和可灌注血管同时形成。神经元通过直接细胞接触和分泌血管生成相关因子促进血管生成，而血管和壁细胞反过来支持功能性神经元成熟。这是一种真正的双向相互关系，但属于发育性和营养性的，而非定义功能性NV偶联的活动驱动性血管张力或血流调节。

外周感觉神经支配伴血管诱导敏化。最接近外周感觉NV组织的体外类似物——因此与牙髓最相关——将内皮细胞与原代背根神经节（DRG）感觉神经元（人和鼠）偶联成可灌注、受神经支配的微血管网络，神经突缠绕血管并与内皮直接接触。此处相互作用超越共同发育，进入功能性血管-神经效应。血管的存在敏化感觉神经元，而神经元保持功能性，实现伤害感受建模。然而，反向臂即神经对血管张力或血流的控制未在该研究中证明。血管运动读数如血管舒张并非该平台报告功能的一部分，作者将其列为未来方向。这是迄今NV整合度最高的外周感觉模型，但仍止步于功能性调节回路之前。

屏障形成、转运与代谢偶联。大量神经血管单元（NVU）/血脑屏障（BBB）芯片文献将脑内皮与星形胶质细胞和/或神经元组装以重建BBB功能。连接芯片NVU模型报道了内皮与神经元区室之间的代谢偶联。全人诱导多能干细胞（iPSC）来源BBB芯片重建具有生理跨内皮电阻的紧密内皮单层，准确预测血脑药物通透性，保护神经细胞免受血浆毒性，并支持患者来源疾病建模。这些模型将NV单元确立为界面，即屏障完整性、分子转运和代谢交换，而非功能性调节回路。

功能性神经肌肉偶联伴共居血管。迄今功能性神经控制另一组织区室的最清晰证明并非来自血管而是肌肉读数。单一EPIREGULIN驱动分化产生含上皮、间充质、肠神经胶质、内皮细胞和有序平滑肌的人肠道类器官。这些类器官形成功能性神经肌肉单元，观察到节律性蠕动样收缩。神经递质诱发收缩被河豚毒素消除，并被氮能（L-NAME）和胆碱能（阿托品）抑制调节，支持肠神经系统依赖性收缩活动。类器官还发育功能性、可灌注血管，在体外与外源内皮网络吻合，移植后与宿主血管吻合。这是在同一类器官中共组装功能性神经元和功能性可灌注血管的里程碑。然而，所证明的功能偶联在神经元与平滑肌之间。神经元与血管之间的功能调节未被检验，仍未确立。

缺口总结。综合这些系统，现有模型涵盖NV共同发育、双向营养影响、外周神经支配血管芯片中的血管诱导感觉敏化、屏障/转运/代谢偶联乃至伴共居血管的功能性神经肌肉偶联。然而功能性双向NV调节回路尚无体外先例。这些模型还共享两个特征：其一，各自从多个分别来源的细胞类型组装，或从iPSC在一个方案内分化成多个谱系；其二，各自模拟中枢神经系统或内脏情境，外周感觉芯片除外。没有一个由单一、临床可获取的成人人类组织构建，其自身细胞内在携带血管周能力和神经室胶质/神经营养支持。这一配置正是牙髓在可获取成人人类组织中沿单源轴最直接提供的。

牙髓是此类底物异常直接的候选者。大脑、肾脏和心脏模型必须从分别来源或分别诱导的细胞类型组装NV微环境的血管、神经和胶质元件，而正是在这些组装系统中受调控偶联迄今仍不可及。牙髓改变了这一起点。它是单一、临床可获取的成人人类组织，天然既血管化又受神经支配，因此微环境元件从起始即大体共居，剩余任务偏向重建其受调控偶联而非首先共组装细胞类型。除上述体内偶联外，它结合了同一可获取成人组织中罕见的两个进一步属性：从拔除牙中常规回收的基质区室，以及间充质、胶质和血管周细胞共享单一颅神经嵴谱系的微环境。

与先前编目牙髓干细胞生物学再生和营养特性的综述不同，本文围绕单一未解决的工程问题重构牙髓：功能性NV偶联的体外重建。若识别出可操作的底物，所得设计原则可能为受同一缺口制约的其他NV偶联组织的平行努力提供信息。动机不仅是方法学上的，也是临床上的。未治疗恒牙龋齿是牙髓炎的主要上游病因，在2021年全球疾病负担研究评估的371种疾病中最为普遍，全球估计22.4亿例。牙髓是牙科最重大决策之一的场所：发炎牙髓能否愈合或必须移除。这一判断仍基于不追踪组织生物学状态的症状标准。NV轴因果参与潜在修复反应：在啮齿动物模型中，感觉神经来源降钙素基因相关肽（CGRP）驱动支持修复性牙本质发生的H型血管生成。手术去神经或药理学CGRP受体阻断削弱血管反应并损害牙本质发生。研究人员认为，为在体外解析和重建该偶联，牙髓是可获取成人人类组织中最直接的单源底物。

1. 2.
   牙髓神经血管微环境：解剖、起源与内在偶联

在将功能性NV偶联定义为体外尚未重建的特征后，本节介绍使牙髓成为研究该偶联异常易处理组织的三个属性。第一个属性是其解剖压缩及随之而来的高细胞分辨率。第二个是其组成谱系共享神经嵴起源。第三个是该组织的NV偶联是内在的且可直接在体内测量。

2.1 解剖压缩与高细胞分辨率

牙髓是封闭在刚性低顺应性牙本质腔室内并经根尖孔供应的软、高细胞结缔组织。其感觉和交感神经支配由胞体位于牙髓外的神经元终末轴突提供，因此牙髓内神经供应是外在神经元群体的外周树状分支。在此受限体积内，这些轴突分支成致密成牙本质细胞下丛。人类前磨牙在近根尖水平接受约2000根无髓和300根有髓轴突，约87%的根尖供应为无髓，有髓部分超过93%为Aδ口径。该丛与同样致密的微血管紧密并置，跨越从软牙髓核心到矿化牙本质的陡峭机械梯度。全组织三维成像已开始直接量化该结构。神经支配和血管各自占据牙髓体积的相当比例，绝大多数血管与神经纤维紧密空间并置，记录全器官尺度的普遍NV毗邻。在单个节段水平，血管运动神经支配集中于小动脉并解析至细于单个小动脉分支点。这些全器官和节段水平测量捕获空间毗邻和血管周神经支配的模式化，区别于神经纤维直接接触血管壁的血管比例。在人牙髓中，约20%的血管在此更严格直接接触标准上携带阳性神经支配，主要为厚壁小动脉。这些血管相关神经中绝大多数表达CGRP、P物质和NPY。在超微结构水平，小鼠下切牙中无髓轴突束与牙髓血管紧密相邻，部分轴突与小动脉平滑肌纤维接触。自然人类功能缺失显示这些纤维群体可分离多远：在遗传性感觉和自主神经病变II型患儿乳牙中，CGRP和P物质免疫反应性缺失，大神经干缺失，而成牙本质细胞下丛减少至少量纤维，根尖无有髓轴突；相反，多巴胺-β-羟化酶阳性血管周纤维持续存在。方法学后果是介导NV相互作用的信号梯度和直接细胞-细胞接触被压缩至亚毫米尺度，处于单细胞和空间转录组方法的空间分辨率内，且器官小到可整体成像和扰动。相对于骨髓或肠隐窝等更大更弥散的干细胞微环境，这种压缩为解析NV相互作用提供了有利信噪比。

2.2 共享神经嵴起源与胶质-间充质连续体

牙髓间充质、成牙本质细胞及相关基质主要源自颅神经嵴，由Wnt1-Cre等Cre驱动子谱系追踪和单细胞调控图谱证明。两条途径填充成人间充质区室：血管周途径和胶质-间充质转化途径，后者中外周胶质产生牙髓间充质细胞，由Plp1/Sox10-CreERT2追踪证明。这些途径在连续生长的啮齿动物切牙中绘制。因此研究人员将胶质-间充质途径的存在视为已确立，其在非生长人牙中的精确定量贡献尚未确定。这一共享起源使牙髓间充质细胞处于神经嵴偏向状态。人牙髓干细胞在3-5代表达神经和胶质标志物而无需神经诱导。整体染色质分析报道多谱系调控位点保持可及而转录沉默。综合来看，微环境的构建材料及神经和胶质信号细胞的来源属于单一共享神经嵴谱系，由已记录的胶质-间充质转化途径连接。研究人员将此解读为证据表明单一牙髓来源群体内在携带NV微环境双臂的谱系信息。这被刻意框定为能力：从起源、染色质状态或标志物表达推断的潜在谱系编码潜能，区别于通过直接功能测定证明的已展示能力。

2.3 神经血管偶联是牙髓内在属性且可在体内测量

第三个特征将牙髓与前述工程化系统区分开来：它已在体内展现这些系统未重建的偶联。文献记载更充分的传出臂从神经到血管：感觉C纤维激活通过神经肽释放增加牙髓血流量，该反应通过激光多普勒血流仪在体内直接证明，并在药理学上表征为逆向、CGRP和P物质介导的血管舒张。反向传入臂受经典工作支持但更具条件性，依赖于牙髓的封闭性。提高牙髓血流量短暂升高低顺应性腔室内组织间液压力，可兴奋Aδ和C纤维，而血流减少抑制Aδ纤维。该压力升高自限，数分钟内因升高的压力驱动液体重吸收而恢复基线。其介导的血流-神经偶联因此是短暂的而非持续的，且尚未以重建所需分辨率的现代方法重新检验。在细胞水平，CGRP驱动的神经-基质-血管轴近期被证明作为前馈回路运作，感觉神经激活牙髓基质细胞，后者上调VEGFA等血管生成因子并在修复期间驱动血管生成。所证明的弧从神经到基质到血管，与强化性串扰一致，但闭合回感觉神经活动本身未被检验。含义是牙髓并非必须假设NV相互作用的组织。至少其传出臂是构成性和可量化的属性，传入臂可证明但更具条件性。在可获取的人类组织中，这使牙髓成为尝试体外重建尚无工程系统实现的功能性NV调节回路的异常坚实基础。

1. 3.
   微环境分子结构：四个信号模块

研究人员围绕四个信号模块组织牙髓NV微环境的分子结构：感觉神经-间充质干细胞轴、血管稳定轴、NV串扰轴和细胞外基质（ECM）基础指导平台。这些作为微环境的四个共存结构组件呈现。其共存所指定的是任何功能性NV偶联体外重建需容纳的配置。每个模块以其概念结论水平陈述。

3.1 感觉神经→间充质干细胞

牙髓中的感觉神经支配并非间充质干细胞生物学的被动旁观者。它是模式化、维持和许可MSC命运的指导性信号来源。三条汇聚证据线支持该表征。首先，三叉神经感觉传入本身产生维持限定MSC区室的信号。三叉神经末梢将音猬因子（Shh）释放至血管周Gli1阳性MSC区室。神经消融耗尽该区室，神经元条件培养基在磨牙细胞中诱导Hh通路转录本。叠加于Shh之上的是FGF1，其结合同一细胞上的FGFR1并通过mTOR依赖性自噬程序维持其存活。神经来源FGF还通过FGFR2作用于Gli1阳性祖细胞以维持Hh信号。BMP的作用不同：其活性在Gli1阳性区室本身不可检测，而在这些细胞的后代中拮抗FGF和WNT信号，静止池由该后代的反馈维持。其次，感觉神经元也是机械感觉换能器，将牙齿负荷转化为间充质指导的化学线索。三叉神经元中的机械门控离子通道Piezo2在牙根形成期间被激活，所得钙离子流驱动PDGFA释放，后者指导下方牙间充质。神经元特异性Piezo2缺失产生可测量根缺陷。第三，MSC对上述所有信号的响应本身在染色质水平受约束。染色质重塑因子ARID1B维持Gli1阳性MSC静止。两个注意事项适用：各轴的谱系追踪和功能缺失证据主要为啮齿动物；这些轴在完整微环境中协同运作。

3.2 血管稳定

牙髓中的血管构建是多轴的，成熟标准是壁细胞覆盖而非内皮管形成。血管生成出芽层已被充分表征。血管内皮生长因子（VEGF）-A通过VEGF受体2（VEGFR2）驱动内皮出芽。在牙髓模型中，VEGF-A还参与介导与宿主血管吻合的VE-钙黏蛋白级联。仅出芽不产生稳定血管。Ang-Tie2轴稳定内皮，并在牙髓环境中与VEGFR2呈拮抗平衡。Tie2非依赖性周细胞募集轴（血小板衍生生长因子[PDGF]-BB作用于PDGF受体β[PDGFRβ]）平行运作，是新生血管壁覆盖所必需的。另外两个DPSC来源输入与PDGF轴并行运作：激活素A在促进血管稳定的同时约束出芽，EphrinB2/EphB4通过Src/FAK作用于DPSC-内皮共培养。物理递送这种稳定性的细胞是血管周MSC。在牙髓中，血管周细胞兼作成牙本质细胞祖细胞储库。同等重要的注意事项：壁细胞能力是来源依赖的。在直接体外和体内比较中，骨髓MSC群体产生更高周细胞比例和更强血管生成趋化，仅骨髓MSC条件培养基增加CAM新生血管化。牙髓稳健血管生成且在口腔MSC来源中排名靠前，但不绝对超越骨髓来源基质。

3.3 神经血管串扰

牙髓中的NV串扰模块由两个重叠参与层组成。在感觉神经肽层，三叉传入将CGRP释放至内皮、间充质和免疫细胞。在胶质营养层，牙髓来源间充质细胞向感觉轴突回供神经营养和基底膜支持。CGRP-RAMP1轴是该对话中文献记载最充分的神经肽臂。在人牙髓中可检测CGRP受体转录本，不可逆性牙髓炎中细胞表面结合CGRP和CGRP结合位点数量均升高。两个独立扰动策略的体内因果研究直接检验该轴：感觉而非交感去神经损害损伤后血管生成和修复性牙本质发生；CGRP受体药理学阻断重现去神经表型。随机四臂研究中，咬合创伤、中度正畸力或两者在体内应用24小时，CGRP和VEGF在四组中分级同步升高，所有配对比较均显著。胶质营养层是互惠臂。牙髓细胞分泌限定神经营养因子面板，包括神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子-3（NT-3）和胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）。功能后果已在三种进一步配置中独立证明：DPSC条件培养基增强原代三叉和DRG感觉神经元神经突生长；微流控双室装置中hDPSC支持比hBMSC显著更长的轴突生长并产生Synapsin I阳性接触；3D对齐胶原-I水凝胶中hDPSC分化为施万样表型并支持髓鞘形成。

3.4 ECM平台

牙髓ECM并非被动支架，而是主动、空间分级的指令集。生长因子储存和定时释放是第一个机制。牙髓糖胺聚糖在基质中螯合TGF-β家族配体，蛋白水解活性以分级、时间受控方式释放这些因子。MMP-20消化牙本质基质释放刺激体内修复性牙本质发生的组分。组成本身具有信息性。纤连蛋白和层粘连蛋白在牙髓中非均匀分布，并根据接触配体将DPSC分化偏向不同命运。脱细胞牙髓基质保留大部分组成模式化，并支持比经典合成基质更快速和更谱系忠实的分化。机械性质构成第三个机制。人牙髓压缩模量约5.5 kPa，牙本质接近20 GPa，跨单一牙齿跨越六个数量级以上。牙髓细胞通过YAP读取拓扑结构。刚度偏向命运，中间刚度有利于血管生成程序，更高刚度有利于矿化，软基质有利于早期成牙本质标志物表达，因此刚度同时设定时机和方向。在构建体水平，重要的是空间布置而非刚度本身。具有不同根尖、根中1/3和冠部刚度区的构建体在体内优于均匀中间刚度对照。

1. 4.
   MSC异质性、双重起源与双重神经血管能力

4.1 亚群结构

人牙髓单细胞转录组学和谱系追踪沿三个轴解析多个MSC亚群：血管周、胶质来源和功能状态。对工程重要的点不是目录本身而是其局限：标志物鉴定已超过功能验证，少数聚类经前瞻性分离-克隆分析-移植三联检验，因此跨研究比较仍缺乏共同功能分母。

4.2 双重起源模型

两条可互换神经嵴途径填充成人MSC池：血管周途径和胶质-间充质转化途径。胶质途径之所以重要是因为其赋予神经源性能力。出生后小鼠牙髓中神经元分化主调控因子转录沉默但保留可及染色质，人DPSC携带牙周膜干细胞缺乏的神经源性聚类。

4.3 功能分层

与起源正交，MSC按状态划分。一个池是慢循环Gli1阳性稳态细胞，神经依赖、受ARID1B静止维持并受BMP作用于其后代。另一个是损伤激活NG2阳性祖细胞，其激活为UPR/ATF6a和Cav1.2依赖性并已在人细胞中确认。

4.4 微环境作为身份共同作者

身份由微环境共同书写。解离和传代侵蚀谱系偏向。异位移植显示细胞保留部分起源记忆，DPSC在相同支架上形成牙本质样而BMSC形成骨样组织，但仍需正确微环境线索实现完整谱系输出。可辩护的综合是起源设定能力而微环境维持和精炼它。

4.5 携带双重神经+血管能力的单一可获取来源

基于起源论点，将牙髓与多源CNS系统区分开来的特征是单一临床可获取成人人类来源内在携带NV微环境双臂的支持细胞性。在神经/胶质侧，牙髓来源保持神经元主调控因子可及但转录沉默状态，携带人神经源性聚类，可重编程为神经源性和胶质源性神经嵴祖细胞，并产生功能性神经衍生物。最直接相关的是其施万样神经营养程序功能上维持感觉神经元存活和神经突生长。感觉神经元本身非牙髓来源，其胞体外在三叉神经节。牙髓提供的是其外周靶场支持。在血管侧，同一可获取来源携带三种不同血管支持能力：VEGFR1阳性亚群在VEGF诱导下预备血管源性分化；PDGFRβ阳性亚群具有促进内皮增殖、迁移和管形成的旁分泌输出；周细胞样壁细胞稳定新生血管。早期体内先例指向同一方向：大鼠牙髓外植体移植至眼前房后数日内血管化，随后被宿主纤维神经支配。双重能力必须精确陈述。最清晰比较优势在神经/神经营养轴：人DPSC表达显著高于人骨髓MSC的NGF、GDNF和NT-3，在微流控共培养中引发显著更长轴突生长。在血管/血管生成轴情况相反：骨髓MSC条件培养基在内皮趋化上优于DPSC条件培养基。牙髓的独特价值因此是单一可获取来源的双轴广度，具有真正神经轴优势，而非统一血管优越性。

4.6 为何选择牙髓而非其他候选底物

前述章节分别构建案例两半：牙髓的解剖可操作性和体内测量偶联，及其单源神经嵴双臂能力。与其他候选底物相比，牙髓的独特概况是组合了可获取成人人类来源、供应双臂的单一可互换谱系，以及完整组织中已可证明的偶联。牙髓并非每轴均优：其他底物在血管成熟度上领先，肠道类器官在已证明功能性偶联上领先。反对牙髓优先策略的最强论据应明确陈述：若实际目标是成熟可灌注血管床，iPSC和类器官系统已实现牙髓未达的血管结局，肠道类器官已展示对组织区室的真正功能性神经控制。牙髓的回应不是其在血管成熟度上胜出，它没有。区别更窄：牙髓从单一成人原代组织供应双臂，谱系共享且临床可获取，传出NV相互作用已可测量，无需定向分化生成组成细胞类型。该构型优势是否超过iPSC系统的血管先发优势和工程可操作性本身是经验问题，本综述框定而非解决。综合来看，在现有NV模型缺失的单源轴上，牙髓在可获取成人人类组织中最接近所需配置。它是单一、可获取、神经嵴来源，其细胞携带血管周能力和神经室胶质/神经营养支持。此外，其NV相互作用已在体内可测量。