N-酰基-N-甲基赖氨酸残基去酰化受损的结构与酶学基础

《Biochemistry》：Structural and Enzymatic Basis for Impaired Deacylation of N-Acyl-N-Methyl Lysine Residues

　　

翻译后赖氨酸乙酰化（acetylation）与甲基化（methylation）通常被认为是ε-氨基上互斥的修饰。近期在组蛋白H4上发现的N-乙酰-N-甲基赖氨酸（KAcMe）表明这两类标记可共存于同一赖氨酸侧链，由此引出该双重修饰是否可被酶促逆转的问题。研究人员合成了含N-酰基赖氨酸或N-酰基-N-甲基赖氨酸的模型肽，并测试其在Zn2+依赖组蛋白去乙酰化酶（HDAC）与NAD+依赖sirtuin作用下的加工情况。相应未甲基化底物可被预期酶去酰化，而含KAcMe的肽未被任一家族可检测地去乙酰化。N-甲基化还阻断HDAC8/11介导的去豆蔻酰化以及SIRT5介导的去琥珀酰化；SIRT2与SIRT6对N-豆蔻酰-N-甲基赖氨酸保留弱去豆蔻酰酶活性。sirtuin–肽复合物的X射线晶体结构、抑制研究和分子对接显示，N-甲基化破坏生产性底物定位并使可裂解酰胺键催化错位。这些发现表明KAcMe抵抗典型赖氨酸去乙酰化酶，可能代表一种持续的染色质相关修饰。

研究背景方面，赖氨酸侧链可携带甲基化、乙酰化、丙酰化、丁酰化、巴豆酰化、丙二酰化、琥珀酰化、戊二酰化、β-羟基丁酰化以及泛素化或SUMO化等翻译后修饰（PTM）。组蛋白赖氨酸PTM对基因表达的表观遗传调控十分关键。传统观点认为，乙酰化与甲基化在同一ε-氨基上互斥；但近期研究显示组蛋白H4上存在N-乙酰-N-甲基赖氨酸（KAcMe），即一个氮原子同时连接乙酰基与甲基，定位于活跃转录起始位点。已知PTM通常由writer添加、由eraser移除以实现动态调控；乙酰化由HAT写入、HDAC擦除，甲基化由KMT写入、KDM擦除。已有体内抑制实验暗示KAcMe可被去乙酰化生成N-甲基赖氨酸，但另一面N-甲基会使Zn²⁺依赖HDAC底物变为稳定抑制剂。因此，双重修饰是否真正可被经典去酰化酶逆转，是未解问题，也是本研究出发点。该论文发表于《Biochemistry》。

主要关键技术方法方面，研究人员采用自动化Fmoc固相肽合成（SPPS）制备H4K5与人工序列模型肽，并在树脂上引入酰基与烷基以得到N-酰基-N-甲基赖氨酸肽；使用UPLC-MS与RP-HPLC监测HDAC和sirtuin的体外去酰化反应；用荧光抑制实验测定肽类对Zn²⁺依赖HDAC的IC₅₀；解析斑马鱼SIRT5与KSucMe肽复合物的X射线晶体结构，以及人SIRT2与N-豆蔻酰-N-甲基赖氨酸类似物及NAD⁺的三元复合物结构；基于优化AlphaFold2（AF2）模型对HDAC11进行分子对接以分析双重修饰肽的结合与错位。

Zn²⁺-Dependent HDACs Are Unable to Deacylate Dually Modified Lysine Residues

研究人员以H4K5Ac、H4K5Myr及人工TFAc肽为底物，发现HDAC1–3、HDAC6可去乙酰化未甲基化肽，HDAC8/11可去豆蔻酰化；但加入N-甲基后，HDAC1–3、HDAC6、HDAC4/5/7/9均不能去酰化H4K5AcMe、H4K5MyrMe与KTFAcMe。抑制实验显示H4K5AcMe仅HDAC6有IC₅₀ 59 μM，人工AcMe肽10抑制HDAC11达8.2 μM，H4K5MyrMe抑制HDAC11为17.2 μM、HDAC8仅中等抑制；说明N-甲基或消除结合或破坏催化化学步。H3K9系列双重烷基/酰基肽显示HDAC11可容纳较大烷基，丙基-棕榈酰组合抑制最强（4.7 μM）。AF2对接表明，未甲基化底物NεH与G151形成氢键，而N-甲基化丢失该氢键并使赖氨酸Nε位移，导致酰基羰基虽配位Zn²⁺和Y304，但割裂酰胺键无法进入催化对齐状态。

Sirtuins Are Unable to Deacetylate and Desuccinylate Dually Modified Lysine Residues

研究人员测试SIRT1–3、SIRT5、SIRT6对H4K5Ac、H4K5Suc及对应Me肽的反应。SIRT1–3与SIRT6可去乙酰化H4K5Ac，SIRT5可去琥珀酰化H4K5Suc；但H4K5AcMe与H4K5SucMe在任何被测sirtuin下均无检测产物。斑马鱼SIRT5–KSucMe晶体结构显示，N-甲基使赖氨酸长侧链扭转，羧基远离Y102与R105，三级酰胺羰基转向约145°离开NAD⁺结合袋，Nε与V221相互作用消失，因而无法启动对NAD⁺烟酰胺核糖C1′的亲核攻击。

Myristoylated Dually Modified Lysine Residues Form Substrates of the Deacylases SIRT2 and SIRT6

研究人员发现SIRT3不能作用，而SIRT2与SIRT6可对H4K5MyrMe进行弱去豆蔻酰化。动力学上，SIRT2对H4K5Myr为3.39 μM s^–1，对H4K5MyrMe降至约0.006 μM s^–1，约降600倍；SIRT6对H4K5Myr为0.0251 μM s^–1，对H4K5MyrMe约降4倍至0.006 μM s^–1。SIRT2–12与SIRT2–12–NAD⁺结构表明，KMyrMe迫使N-甲基转向Rossmann折叠域并采用cis-酰胺构象，使酰胺离开V233氢键网络但仍可微弱催化。

讨论与结论部分，研究人员指出，KAcMe不能被Zn²⁺依赖HDAC与NAD⁺依赖sirtuin有效去乙酰化，使本可逆的乙酰化因共存的N-甲基变为实际不可逆；N-甲基通过空间位阻与氢键丢失扰乱底物在活性袋中的生产型定位，令可裂解酰胺键错位。唯一例外是长链N-豆蔻酰-N-甲基赖氨酸仍可被SIRT2/SIRT6弱去豆蔻酰化。结论可译为：N-乙酰-N-甲基赖氨酸抵抗典型赖氨酸去乙酰化酶，可能作为一种持久性染色质相关修饰存在；该双重PTM拓展了位点共修饰的化学边界，也提示表观遗传标记并非全部处于快速writer/eraser循环之中。