无保护基策略的S-糖苷化方法用于复杂S-糖肽合成

《JACS Au》：A Protecting-Group-Free S-Glycosylation Strategy for Complex S-Glycopeptide Synthesis

　　

无保护基(PG-free) S-糖苷化可为糖肽合成提供有吸引力的策略，但面向复杂肽的实用方法仍有限。研究人员报道一种非光化学 S-糖苷化策略，使未保护糖基供体与含半胱氨酸(Cys)的未保护肽直接偶联，高效获得 β-S-糖肽。该方法对糖基供体和肽底物具有广泛兼容性，可对含一个游离 Cys、四个受保护 Cys 及氧化敏感官能团的结构复杂 37-mer 前体直接糖基化，从而高效合成 sublancin(亚兰霉素) 及多种糖基化类似物。与产生 α-S-糖肽且不适用于全长底物的光化学自由基 S-糖苷化不同，本策略可实现结构复杂肽的后期糖基化。结合基于片段的天然化学连接(native chemical ligation, NCL) 合成 α-S-糖苷键的方法，该平台可提供立体化学明确的 sublancin 类似物，并揭示 S-糖苷键构型强烈影响抗菌活性。结果建立了用于复杂 S-糖肽合成与 glycocin 构效关系研究的实用 PG-free 平台。

研究背景方面，肽和蛋白质的糖基化在分子识别、免疫调控和细胞信号传导中起核心作用。S-连接糖链因具有天然 O-糖链的水解稳定性模拟物特征，可作为研究糖蛋白结构与功能的探针。S-糖基化是 glycocin（一类核糖体合成并翻译后修饰肽，RiPPs）的定义性结构特征，典型代表为 sublancin（1）。已有研究用 DMC 介导激活未保护糖生成芳基硫糖苷，用 Ca 促进未保护糖基氟化物进行 O-糖基化；Li 等用未保护糖基氟化物和 Ca(OH)₂ 在水中实现 β-选择性短肽 S-糖基化；Niu 等用光化学自由基策略得到 α-S-糖肽。但针对长链、半胱氨酸丰富的复杂肽底物的直接 β-S-糖基化实用方法仍有限，因此研究人员在《JACS Au》发表该研究，开发非光化学 PG-free 策略以实现复杂 glycocin 前体后期 β-S-糖基化。

主要关键技术方法包括：以谷胱甘肽为模型肽系统优化碱、溶剂和温度条件；用结构多样的未保护糖基氟化物（葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖及二糖）与含 Cys 肽底物进行范围考察；构建含一个游离 Cys 与四个 Acm 保护 Cys 的 37-mer sublancin 前体进行后期糖基化、脱保护与氧化折叠；用光化学自由基法在短肽片段上制备 α-S-糖基化片段并经 NCL 组装 α-S-葡萄糖基 sublancin 类似物；以 Bacillus subtilis CGMCC 1.3358 为测试菌株进行 MIC 抗菌评价；用 AlphaFold 3 建模 sublancin 与 PTS 组件 PtsG、PtsH、PtsI，并对 Ser–Glc 替代物与 PtsG_1–422 进行 1 μs 显式溶剂分子动力学(MD) 模拟。

研究结果部分，Evolution of PG-free strategies for peptide S-glycosylation 通过梳理已有 Li 等 β-选择性短肽策略、Niu 等光化学 α-选择性策略，说明本研究提供非光化学 PG-free 的复杂富 Cys 肽后期 β-S-糖基化路线。Optimization of Glutathione S-Glycosylation through Systematic Evaluation of Glycosyl Donors, Bases, Solvent Systems, and Reaction Temperatures 通过谷胱甘肽模型考察碱、溶剂、温度与离去基团，得出 Ca(OH)₂ 配合 DMSO:H₂O = 1:3、50 °C 时未保护糖基氟化物供体可得 91% β-S-糖肽，而 Br/Cl 供体产率低于 10%。Scope of the PG-Free S-Glycosylation with Structurally Diverse Glycosyl Fluoride Donors and Cysteine-Containing Peptides 通过多种糖基氟化物与酸碱性寡肽、双 Cys 肽、二糖供体反应，得出该方法对供体与受体兼容性好，双 Cys 肽可得 77% 与 74% 双糖基化产物且多位点无显著内在选择性，二糖供体得 86% 与 84%。PG-free glycosylation strategy for late-stage synthesis and diversification of sublancin analogues 通过 37-mer 前体直接葡萄糖基化得 91% β-S-葡萄糖基前体并转化为 sublancin，换用半乳糖、GlcNAc、Glc-6-Dan 等供体从一个共同前体获得多样类似物；MIC 显示半乳糖类似物(16) 活性接近天然 sublancin，GlcNAc 类似物(17) 抗菌效力约降 5 倍，Glc-6-Dan 类似物(18) 无 detectable 抗菌活性。Synthesis of the α-S-glucosyl analogue of sublancin 通过直接光化学处理全长前体转化差且肽分解，改在短片段光化学 α-S-糖基化后经 NCL、脱保护、氧化折叠获得 α-S-葡萄糖基类似物(19)；H–H COSY 中 H1′ 与 H2′ 相关 J = 4.2 Hz 确证 α-键。

讨论与结论部分，研究人员用 AlphaFold 3 与 MD 发现 β-葡萄糖基复合物与 PtsG 保持持续肽—PtsG 和糖—PtsG 接触，受体 RMSD 稳定；α-葡萄糖基复合物虽仍接触 PtsG，但 RMSD 更高、波动更大，与其无 detectable 抗菌活性一致，但模拟本身不能确立波动与失活因果关系。结论部分翻译如下：总之，研究人员开发了在非光化学条件下使用未保护糖基供体与含半胱氨酸肽进行肽 β-S-糖基化的高效 PG-free 策略。该方法底物兼容性广，可稳健用于结构复杂富半胱氨酸 glycocin 前体的后期糖基化。该策略可从共同肽前体快速获得多种 sublancin 类似物，推动该重要 glycocin 家族成员的构效关系研究。此外，抗菌活性对 S-糖苷键立体化学的显著依赖，确立了糖链几何构型作为 glycocin 识别与功能的关键决定因素。更广泛地，本策略将促进 glycocin 工程、糖肽化学生物学以及糖基化肽类天然产物后期多样化研究。