拉曼光谱与AFM-IR光谱在表征分离自小胶质细胞和胶质母细胞瘤细胞的巨质膜囊泡中的应用

《Langmuir》：Raman and AFM-IR Spectroscopy in the Characterization of Giant Plasma Membrane Vesicles Isolated from Microglia and Glioblastoma Cells

　　

巨质膜囊泡（Giant Plasma Membrane Vesicles, GPMVs）被广泛用作生物膜的细胞来源模型，然而其光谱表征仍十分有限。在本工作中，研究人员提出了一套制备和分析工作流程，使拉曼光谱和基于原子力显微镜的红外光谱（Atomic Force Microscopy-based infrared, AFM-IR）能够对分离自小胶质细胞（人小胶质细胞克隆3，human microglial clone 3, HMC3）和胶质母细胞瘤（LN229、U87 MG和U251 MG）细胞系的GPMVs进行光谱研究。研究人员系统评估了储存条件和分离参数，以确保在进行光谱测量前保持囊泡的形态和生化稳定性。拉曼光谱提供了GPMV组成的无标记分子指纹，揭示了取决于囊泡细胞来源的脂质和蛋白质贡献差异。通过AFM-IR光谱实现了互补表征，能够在纳米尺度上检测碳水化合物、蛋白质和脂质相关振动带的差异，而无需样品标记。包括主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）和偏最小二乘判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis, PLS-DA）在内的化学计量学分析进一步证实了来源于不同细胞系的囊泡的光谱判别。据研究人员所知，本工作代表了GPMVs的拉曼与AFM-IR组合光谱研究之一，展示了多模态振动光谱在表征细胞来源膜系统方面的潜力。所提出的方法为未来膜衍生囊泡及其生化异质性的光谱研究奠定了基础。

**研究背景**

巨质膜囊泡（Giant Plasma Membrane Vesicles, GPMVs）是研究细胞膜结构与组织最广泛使用的模型系统之一。细胞膜由脂质和蛋白质以复杂的动态方式组织，受热力学约束控制。GPMVs通过化学诱导活细胞质膜出泡生成：通常使用多聚甲醛（paraformaldehyde, PFA）交联膜相关蛋白，二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）还原二硫键，从而削弱质膜与皮层肌动蛋白细胞骨架之间的偶联，促进膜泡形成和释放。GPMVs保留了质膜大部分的天然脂质和蛋白质组成，同时保留细胞质内容物（不含细胞内细胞器）和以糖蛋白、糖脂形式存在的聚糖，直径通常约3–20 μm。然而，既往GPMV研究主要集中于生物物理性质，如弯曲刚度、膜微粘度和自发膜曲率等；多数研究采用荧光显微镜结合特异性荧光探针进行分析。相比之下，应用振动光谱表征GPMVs的研究十分有限，仅有表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）和傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared, FT-IR）的少量报道。因此，本研究旨在建立结合拉曼光谱与基于原子力显微镜的红外光谱（AFM-IR）以及化学计量学分析的工作流程，对小胶质细胞和胶质母细胞瘤细胞系来源的GPMVs进行无标记、无损表征。

**研究内容与总体结论**

研究人员从人小胶质细胞克隆3（human microglial clone 3, HMC3）和三种胶质母细胞瘤细胞系（LN229、U87 MG、U251 MG）中分离GPMVs，系统评估了储存条件和分离参数，以确保光谱测量前囊泡形态和生化稳定性得以保持。研究发现，在+4 °C分离缓冲液中储存的GPMVs在14天内未检测到明显的形态或生化组成变化；而在?20 °C、?80 °C和液氮条件下储存会导致囊泡结构破坏。拉曼光谱提供了GPMV组成的无标记分子指纹，揭示了不同细胞来源囊泡的脂质和蛋白质贡献差异；AFM-IR光谱在纳米尺度（约20 nm空间分辨率）上检测到碳水化合物、蛋白质和脂质相关振动带的差异。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）和偏最小二乘判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis, PLS-DA）进一步证实了不同细胞系来源囊泡的光谱判别。据研究人员所知，这是首批将拉曼与AFM-IR光谱联合应用于GPMVs的研究之一，展示了多模态振动光谱在表征细胞来源膜系统方面的潜力。该论文发表在《Langmuir》期刊上，所建立的方法为未来膜衍生囊泡及其生化异质性的光谱研究奠定了基础。

**关键技术方法**

本研究的关键技术方法包括：(1) GPMV分离与制备：采用DTT/PFA分离缓冲液处理细胞3小时，收集囊泡并沉积于氟化钙（CaF₂）基底上干燥；(2) 储存稳定性评估：使用相差显微镜观察不同温度条件储存后的囊泡形态；(3) 拉曼光谱测量：532 nm激光激发，光谱范围400–3200 cm^?1；(4) AFM-IR光谱测量：采用量子级联激光器，指纹区764–1858 cm^?1及高波数区2600–2996 cm^?1，接触模式共振增强检测；(5) 化学计量学分析：PCA、PLS-DA及方差分析（analysis of variance, ANOVA）结合Tukey事后检验。细胞来源：HMC3、LN229、U87 MG来自ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯），U251 MG来自ECACC（德国达姆施塔特默克公司）。

**研究结果**

**GPMV储存与样品制备。** 研究人员通过相差显微镜评估了不同储存温度对GPMV形态的影响。结果表明，在?20 °C、?80 °C和液氮中储存7天后，囊泡典型形态消失，出现膜损伤和内容物泄漏；而在+4 °C储存条件下，囊泡形态可保持长达42天。分离时间优化实验显示，1–3小时内囊泡数量和直径显著增加，6–24小时后达到平台期；HMC3细胞产生的囊泡较少且倾向于形成簇，U87细胞即使在较低汇合度下也能更易产生囊泡，表明囊泡生产效率取决于细胞来源。基于上述结果，研究人员选择3小时为最优分离时间。拉曼光谱监测储存期间生化变化发现，14天内未观察到脂质或蛋白质相关信号的显著差异，但超过14天后出现明显光谱改变，其中1660/1440 cm^?1强度比下降提示可能发生脂质氧化。PCA将光谱分为1–14天和21–35天两组，沿PC4存在区分趋势。

**拉曼光谱分析GPMV异质性。** 对储存7天的干燥GPMVs进行拉曼光谱分析。平均光谱以蛋白质贡献为主，未检测到核酸特征带（约785 cm^?1），证实GPMVs内不含DNA和RNA。ANOVA分析显示，U251来源囊泡在720 cm^?1带（含胆碱磷脂）强度显著高于LN229和HMC3；LN229来源囊泡在1005 cm^?1（苯丙氨酸）强度显著更高，提示蛋白质贡献增加；1660/1440 cm^?1比值表明LN229囊泡含有较高比例的不饱和脂质；LN229囊泡还在750和1585 cm^?1处表现出增强的拉曼强度，这些谱带与含卟啉蛋白（包括细胞色素相关结构）相关。二维和三维可视化图显示LN229数据集与其他样品明显分离。成对PCA和PLS-DA分析进一步证实了不同细胞来源GPMVs的拉曼光谱指纹差异，PLS-DA交叉验证R²值为0.8135–0.8333，LN229来源囊泡表现出区别于HMC3及其他胶质母细胞瘤细胞系囊泡的光谱特征。

**AFM-IR光谱在GPMV生化表征中的应用。** AFM-IR光谱用于补充拉曼结果并获得局部化学信息。ANOVA分析显示碳水化合物/多糖特征带（1054和1154 cm^?1）在HMC3微胶质囊泡中贡献显著高于胶质母细胞瘤来源囊泡，在LN229中最低。蛋白质相关酰胺I和酰胺II带总贡献以U251最高，HMC3较低；β-折叠/α-螺旋比值（1694/1664 cm^?1）在U251中最低。脂质相关带（1744和1246 cm^?1及2852/2958 cm^?1比值）也显示显著差异：HMC3囊泡的胆甾醇酯相关信号最高，U251囊泡的磷脂相关带贡献增加且脂肪酸酰链较长，U87囊泡的酰链长度参数最低。成对PCA中，酰胺I、酰胺II区域及1744 cm^?1羰基区域反复贡献于HMC3与胶质母细胞瘤来源囊泡的区分，表明蛋白质二级结构差异是重要的光谱判别因素。对照实验确认，经超纯水冲洗并从无晶体沉积区域采集光谱后，残留分离缓冲液对AFM-IR光谱的贡献可忽略。

**讨论与结论**

讨论部分指出，拉曼光谱和红外光谱在生物样品中具有互补灵敏度：GPMVs的拉曼光谱主要由蛋白质和脂质信号主导，碳水化合物相关振动较弱且常与蛋白质、脂质带重叠；而红外光谱对碳水化合物振动特别敏感，因此AFM-IR能够检测微胶质和胶质母细胞瘤来源GPMVs中聚糖和碳水化合物相关带的差异。这种互补性是本研究联合应用两种技术的核心动机。

结论翻译：本研究提出了一种用于制备和表征来源于小胶质细胞和胶质母细胞瘤细胞系的GPMVs的光谱工作流程。结果确立了光谱测量前GPMV样品制备和储存的实用指南，证明在+4 °C的分离缓冲液中储存时，囊泡形态和生化稳定性可保持长达14天。相反，在较低温度下储存会导致囊泡结构破坏，强调了受控储存条件对可靠光谱分析的重要性。拉曼光谱和作为互补技术的AFM-IR光谱还实现了对分离囊泡生化组成的无标记表征，并根据GPMVs的细胞来源揭示了脂质、蛋白质和碳水化合物贡献的可测量差异。拉曼光谱提供了膜组成的整体分子指纹，而AFM-IR光谱能够对膜沉积物进行纳米级红外表征，提供关于生化异质性的互补信息，如蛋白质二级结构和碳水化合物的生化信息。化学计量学分析进一步证实，GPMV样品的光谱特征可以区分不同细胞系来源的囊泡沉积物，突出显示脂质组织、蛋白质贡献以及膜相关组分（如磷脂和胆固醇相关物质）的差异。所提出的方法证明GPMVs可以作为与振动光谱技术兼容的稳健质膜模型。重要的是，拉曼和AFM-IR光谱的组合提供了一种强大的分析方法，可在无需标记或大量样品改性的情况下研究细胞来源囊泡的分子组成。这种方法可能促进对质膜组织、脂质-蛋白质相互作用以及与细胞过程和病理状态相关的生化改变的进一步研究。