《Science Progress》：Exploring candidate biomarkers for nonobstructive azoospermia: A bioinformatics and machine learning approach
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目的：非梗阻性无精子症（NOA）是一种严重的男性生殖障碍疾病，发病机制复杂。本研究旨在利用生物信息学方法鉴定NOA的新型氧化应激潜在生物标志物。
方法：来自GEO数据库的GSE9210、GSE108886和GSE45885数据集用于训练，GSE145467用
目的：非梗阻性无精子症（NOA）是一种严重的男性生殖障碍疾病，发病机制复杂。本研究旨在利用生物信息学方法鉴定NOA的新型氧化应激潜在生物标志物。
方法：来自GEO数据库的GSE9210、GSE108886和GSE45885数据集用于训练，GSE145467用于支持加权基因共表达网络分析。研究人员利用limma包鉴定差异表达基因，并与来自GeneCards的氧化应激基因交叉比对以进行药物预测。三种机器学习算法鉴定了潜在核心基因，并由GSE45887和GSE216907验证。针对这些核心基因进行了深入分析，包括调控网络和单基因富集研究。qRT-PCR验证了核心基因表达，单细胞RNA测序（GSE149512和GSE202647）探索了细胞表达模式。
结果：IL1RN、NOSIP、PDYN、PRKCZ和UTRN是潜在的NOA标志物。qRT-PCR验证证实IL1RN、NOSIP、PRKCZ和UTRN与生物信息学结果一致。单细胞分析显示这四个基因在NOA中呈现阶段特异性失调。
结论：本研究拓宽了已知NOA候选生物标志物的范围，并增强了对NOA的理解。
Xi Luo等研究人员在《Science Progress》发表了一项关于非梗阻性无精子症候选生物标志物的整合生物信息学研究。非梗阻性无精子症（NOA）约占不育男性的10%，以精子发生失败为主要特征，可由基因突变、细胞黏附异常和血睾屏障减弱等因素引起，但仍有大量病例病因不明。氧化应激（OS）会损害精子质量与功能，导致DNA损伤和不育，在NOA中尤其显著。因此，理解OS在NOA中的作用机制对于开发新的诊疗策略具有重要意义。该研究利用公共数据库和高通量组学数据，结合机器学习与单细胞分析，系统筛选并验证NOA的氧化应激相关候选生物标志物。
研究人员从基因表达综合数据库（GEO）获取了6个批量RNA测序数据集和2个单细胞RNA测序数据集。训练集由GSE9210、GSE108886和GSE45885组成，验证集为GSE45887和GSE216907，GSE145467用于加权基因共表达网络分析；共纳入154例睾丸组织样本，包括38例梗阻性无精子症（OA）和116例NOA，以OA作为精子发生正常的对照。qRT-PCR验证样本来自广州妇女儿童医疗中心柳州医院2024年8月至12月收集的睾丸组织，包括6例NOA和6例OA。主要技术方法包括：利用limma包进行差异表达基因筛选；通过WGCNA识别NOA相关共表达模块；将差异表达基因、WGCNA关键模块基因与GeneCards氧化应激基因取交集获得候选基因；采用三种机器学习算法——最小绝对收缩与选择算子（LASSO）、随机森林（RF）和支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）筛选核心基因；通过受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断价值；构建列线图并验证其预测性能；利用NetworkAnalyst预测miRNA-转录因子调控网络；通过单基因基因集富集分析（GSEA）探索功能；使用qRT-PCR验证基因表达；利用单细胞转录组数据鉴定细胞类型并进行拟时间轨迹分析；通过Enrichr/DSigDB数据库和分子对接进行小分子探索性筛选。
研究结果如下。
差异表达基因鉴定：与OA相比，NOA组共鉴定出1285个差异表达基因（DEGs），其中407个上调、878个下调，表达模式具有明显聚类特征。
WGCNA关键模块筛选：通过WGCNA排除离群样本后，以软阈值β=8构建共表达网络，得到31个基因共表达模块。其中蓝色、洋红色、钢蓝色和绿松石色模块与NOA显著相关（相关系数>0.7，P<0.001），共包含4770个靶基因。
氧化应激相关DEGs的获得与富集分析：将DEGs、WGCNA关键模块基因和氧化应激相关基因取交集，获得78个DEOSGs。基因本体（GO）分析显示这些基因与类固醇激素反应相关；京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示其参与谷胱甘肽代谢、前列腺癌和化学致癌-活性氧等通路。
机器学习与核心基因鉴定：LASSO、SVM-RFE和RF三种算法筛选结果取交集后得到6个候选基因，包括IL1RN、NOSIP、PDYN、PRKCZ、UTRN和GLUL。ROC分析显示IL1RN、NOSIP、PDYN、PRKCZ和UTRN在训练集和两个独立验证集中的曲线下面积（AUC）均大于0.7，被认定为关键诊断基因。
列线图构建与验证：基于上述5个基因构建的logistic回归列线图模型具有较好的校准能力和临床净获益；在训练集和验证集中，NOA患者这5个基因的表达水平均低于OA对照组。
蛋白互作与调控网络：蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络显示核心基因及其20个互作伙伴参与TGF-β应答、细胞连接和生长因子结合等功能。miRNA-mRNA-转录因子调控网络包含32个miRNA和33个转录因子，提示核心基因受到多层次上游调控。
单基因GSEA：NOSIP、PDYN和PRKCZ主要与精子细胞发育、分化、精子发生和细胞周期相关；IL1RN和UTRN也表现出与相关生物学过程的关联。
qRT-PCR验证：在NOA睾丸组织中，PRKCZ、IL1RN、NOSIP和UTRN的相对表达水平分别为0.08、0.52、0.13和0.66，均显著低于OA组，与生物信息学分析一致。PDYN因熔解曲线显示持续非特异性扩增，为保证数据可靠性被排除。
单细胞转录组分析：共注释出14个细胞簇，包括精原细胞、精母细胞、精子细胞、支持细胞、间质细胞、管周肌样细胞、巨噬细胞和内皮细胞。与NOA组相比，OA组精原细胞、精母细胞和精子细胞比例更高，巨噬细胞比例更低。IL1RN主要在巨噬细胞中表达，UTRN主要在内皮细胞中表达，NOSIP和PRKCZ主要在生殖细胞尤其是精子细胞中表达。拟时间轨迹分析显示，在正常精子发生中四个基因均具有阶段特异性表达特征；而NOA中IL1RN在精子发生过程中持续低表达，NOSIP在晚期精子细胞中表达峰缺失，PRKCZ在精母细胞阶段的上调模式异常，UTRN在精子发生过程中受到抑制。
小分子对接：DSigDB数据库筛选出白藜芦醇（RSV）等候选小分子。分子对接显示RSV与IL1RN、NOSIP、PDYN、PRKCZ和UTRN均具有理论结合亲和力，结合能在-6.0至-7.6 kcal/mol之间。但研究强调该结果仅为探索性计算机筛选，不能直接证明实际结合或治疗疗效。
讨论部分指出，IL1RN编码白细胞介素-1受体拮抗剂，具有抗炎作用；NOA睾丸中IL1RN表达降低可能不足以抑制氧化应激引起的炎症。PRKCZ编码蛋白激酶Cζ，可通过MAPK和PI3K/Akt通路参与氧化应激应答；NOSIP通过与一氧化氮合酶相互作用调节一氧化氮产生，一氧化氮可清除自由基并抑制脂质过氧化。这些基因的下调可能削弱内源性抗氧化防御机制，加剧睾丸微环境氧化损伤。但NOA病因复杂，OS效应与遗传和激素因素交织，核心基因应置于该复杂网络中考量。研究还指出RSV的临床价值仍有争议，需进一步实验验证。该研究的优势在于整合批量转录组和单细胞转录组，将组织水平变化定位到特定细胞类型，并构建了具有较强判别能力的诊断模型。局限性包括未对NOA进行详细亚型分层、样本量有限、不同平台残余批次效应、转录组相关性不能确证因果、单细胞分析缺乏空间背景等。未来需要大规模前瞻性队列、蛋白水平功能实验和空间转录组学进一步验证。
研究结论认为，IL1RN、NOSIP、PRKCZ和UTRN是与氧化应激相关的NOA候选生物标志物，本研究增强了对NOA病理机制的理解。
