形状限制检测天然产物毒物兴奋效应：复杂植物混合物的再分析

《Dose-Response》：Shape-Restricted Detection of Natural Product Hormesis: A Re-Analysis of Complex Botanical Mixtures

　　

摘要

引言：植物补充剂被消费以改善健康，尽管其作用机制仍属未知。一种可能的作用是毒物兴奋效应（hormesis），定义为在低剂量下产生有益和刺激性的健康效应，而在高剂量下产生有害效应，或反之亦然。毒物兴奋效应通常通过人工检查剂量-反应曲线的形状来发现，这无法扩展到高通量筛选（high-throughput screening, HTS）结果中大量的化学-检测组合。

方法：研究人员提出了一种半自动统计检验程序，用于快速评估大规模剂量-反应数据，并附带一个R包shorm以便于实施。非参数形状检验更加灵活且假设较少。研究人员还开发了一种新的可视化方法，同时呈现检验结论和不确定性。这种表示方式突出了显著性和模糊性发现，以便高效检查。

结果：研究人员将该方法应用于包含4860个化学-检测对的数据集，并识别出561条（12%）剂量-反应曲线显示出统计学显著的毒物兴奋效应。

结论：研究人员发现的毒物兴奋曲线与Tox21等剂量-反应数据库中关于毒物兴奋行为的估计一致。研究人员提出的方法已有效用于从大规模剂量-反应数据中筛选毒物兴奋效应，且可视化方法有效促进了检验结果的解释。

图形摘要

形狀限制检测天然产物毒物兴奋效应：复杂植物混合物的再分析——论文解读

一、研究背景与问题

天然产物（包括植物药和其他膳食补充剂）因其被认为具有健康效应而被公众广泛消费。部分益处可能来自植物化学物质诱导的轻度细胞应激，进而触发适应性保护反应，这一原理也可能解释传统中医和阿育吠陀的部分机制。然而，许多天然产物是复杂的化学混合物，仅针对单一分子和通路的研究范式难以反映其多因素复杂性。即使了解作用模式，确定合适剂量也需要在精细剂量网格上进行实验，而商业化补充剂通常未进行此类实验。因此，植物药和补充剂是非单调剂量-反应在生物学上具有合理性但尚未被充分探索的实例，这促使研究人员对现有反应数据进行再评估。

直接测量天然产物效应的一种方式是进行体外细胞实验，结合多种检测方法，如21世纪毒理学项目（Toxicology in the 21st Century program, Tox21）的高通量筛选（high-throughput screening, HTS）结果。Hubbard等人（2019）使用Tox21数据评估了多种美国消费者关注的常见植物产品，他们拟合参数模型并报告半最大效应浓度（EC50），同时比较全植物形式与纯活性成分。然而，为了理解补充剂的健康效应，需要重点关注低剂量行为，这引出了毒物兴奋效应（hormesis）的概念。毒物兴奋效应是一种剂量-反应作用，其中生物系统对足够低但具有应激性的暴露剂量表现出刺激反应，而较高剂量导致抑制反应，或反之。这是一种高度保守的进化适应现象，Calabrese和Kozumbo（2021）提出了基于氧化还原激活转录因子Nrf2的广义机制：低剂量应激源可激活Nrf2介导的细胞保护机制，从而增强细胞对未来更大威胁的抵抗力。据估计，Tox21等来源的剂量-反应关系中高达40%可能在实验剂量范围内表现出毒物兴奋效应。识别这类反应有助于发现化合物的低剂量益处。

在实践中，毒物兴奋效应通常通过人工绘制剂量-反应曲线并观察J形或倒J形（而非单调S形）来识别，J形凹陷幅度预期为基础反应的30%-60%。但对于涉及数千种化学-检测组合的HTS，人工检查不可行，且视觉分类易受数据噪声影响。常用的统计方法是拟合参数剂量-反应模型并检验毒物兴奋参数，如Brain-Cousens模型和Cedergreen等（2005）的扩展模型。然而，参数方法对曲线形状施加刚性假设，模型误设可能导致不可靠的检验结果。因此，需要一种基于形状的统计检验方法，直接评估数据的单调性和凹凸性，从而以最少假设识别毒物兴奋曲线。

二、研究内容与主要贡献

研究人员提出了一种基于形状的统计检验框架，用于从大规模剂量-反应数据中筛选毒物兴奋效应。该框架利用半参数形状限制混合效应回归样条（Shape-Restricted Mixed Effects Regression Splines, SRMERS）方法，具体采用SHARP（SHApe Restricted Procedure）检验。通过拟合单调性模型和凸性模型，分别使用二次I样条基函数和三次C样条基函数，检验剂量-反应曲线的单调增加/减少和凸/凹性质。对每个模型，系数向量在零假设下检验是否全部为正或全部为负，得到四个p值：pin（增加）、pde（减少）、pcx（凸）和pcv（凹）。采用Holm方法进行多重比较校正。由于检验统计量的零分布无闭式解，通过自助法（bootstrap）重复抽样估计p值。为降低随机波动，对每条剂量-反应曲线重复运行SHARP检验并取中位数p值作为稳健结论。

研究人员还开发了一种新颖的可视化方法，将多个曲线的检验p值和形状结论整合到一个二维平面中。平面由两个轴划分：水平轴表示凸对比凹，垂直轴表示减少对比增加。每个化学-检测对以一个点表示，其位置由四个p值决定。通过比较p值大小确定点所在的子空间，p值越小越靠近边缘。图中绘制四条虚线对应显著性阈值α=0.05，将平面分为中心区域和八个边缘区域。显著形状的点位于边缘区域，不显著的点位于中心区域，接近阈值的点需要进一步研究。为了改善视觉效果，使用对数基函数变换坐标轴，使显著（边缘）区域扩展，不显著（中心）区域收缩。研究人员将该方法实现为R包shorm，基于SRMERS包扩展了重复检验函数和散点图可视化功能，发布在CRAN上。

三、数据与方法概述

研究使用了与Hubbard等人（2019）相同的Tox21程序数据集，包含19个植物组、90种不同制备物（提取物、成分、油等），以及19种检测（如芳烃受体AhR、抗氧化反应元件ARE、芳香化酶受体活性等），扩展为54种筛选结果（根据报告基因类型：荧光素酶LUC、β-内酰胺酶BLA、活力VIA，以及时间过程）。时间过程检测在0至40小时（以8小时为增量）孵育后测量肝或肾细胞的活力/细胞毒性。每个实验有三个重复，重复合并分析。响应数据通过阳性对照归一化：响应活性=（V化合物?V二甲基亚砜）/（V阳性?V二甲基亚砜）×100%。SHARP检验对每条剂量-反应曲线重复运行，取中位数p值作为最终分类。

四、研究结果

（一）毒物兴奋曲线的总体识别

研究人员对所有化学-检测对应用形状检验，共4860个组合，识别出561条（12%）曲线具有统计学显著的毒物兴奋效应（J形或倒J形）。热图分析显示明显的水平和垂直模式，表明某些检测或化学物质一致性地表现出毒物兴奋效应。姜黄（Turmeric）组和银杏（Ginkgo Biloba）表现出最高水平的毒物兴奋活性，姜黄有157条曲线（58.15%）为毒物兴奋，银杏91条（18.72%）。此外，金印草（Goldenseal）在AHR、ARE和MMP检测中表现一致，而ARE检测对树胶古古尔（Gum Guggul）、卡瓦胡椒（Kava Kava）和柠檬醛（Citral）也显示活性。槲皮素（quercetin）作为银杏的主要活性成分，显示出仅次于姜黄的毒物兴奋活性。

（二）检测类型与时间过程分析

在不同检测中，抗氧化反应元件（ARE）检测显示出最高计数和比例的毒物兴奋结果（38条，42.22%），其次是MMP（23条，25.56%）、芳香化酶ER激动剂（20条，22.22%）和芳香化酶ER拮抗剂（18条，20%）。活力检测（viability）在不同时间点（0-40小时）显示出不同的毒物兴奋计数，其中0小时时HepG2-GLO检测有34条（37.78%）毒物兴奋曲线，随时间增加而减少。研究人员指出，在时间过程检测中发现毒物兴奋意味着在给定时间点存在关于浓度的J形曲线，而非关于时间的J形曲线。

（三）潜在毒物兴奋曲线

热图中，毒物兴奋曲线常与同一检测或植物组中的其他显著形状共存。例如，金印草和姜黄的芳香化酶检测显示出U形和毒物兴奋曲线的聚集；卡瓦胡椒的荧光素酶检测显示单调和毒物兴奋曲线共存；肾细胞hek293-glo的时间过程检测显示许多U形曲线。这些U形曲线可能在高剂量下揭示毒物兴奋反应，而单调曲线可能在更低剂量下显示毒物兴奋。这些化学物质和检测需要在扩展剂量网格上进行进一步研究。

五、讨论与结论

研究人员提出了一种高效、半自动的毒物兴奋效应筛选方法，基于统计检验评估剂量-反应曲线的单调性和凹凸性。与现有模型方法相比，该检验不需要指定参数形式，具有灵活性并避免了对特殊公式的限制。可视化方法允许高效检查和解释检验结果。从Tox21数据中识别的一些毒物兴奋通路与现有文献一致，如ARE通路常见于毒物兴奋作用，Nrf2与ARE结合增强抗氧化基因表达；金印草激活的芳烃受体（AhR）已知在Tox21数据集中表现毒物兴奋；内分泌干扰化学物质在雌激素受体（ER）和雄激素受体（AR）上已知具有非单调剂量-反应，研究人员在两个检测中都发现了毒物兴奋例子。

研究方法需要注意边缘情况，即一种形状过渡到另一种形状的情况。p值和结果可能模糊，因此建议审查任何显著发现。散点图可提高审查效率，因为它突出所有显著结果（边缘）和高度模糊的结果（接近显著阈值）。SHARP检验需近似检验分布以确定p值，因此存在变异性，建议运行10至20次并采用中位数p值或众数形状类别。研究人员未深入探讨跨检测和化学组合的族系错误率控制，但指出可采用Bonferroni或Benjamini-Hochberg校正，留待未来工作。另一个限制是SHARP不考虑毒物兴奋曲线初始“凹陷”的幅度，仅识别J形曲线但不能检验相对于阳性对照的初始刺激/抑制区间变化百分比。更精确地指定毒物兴奋效应（如预先指定凹陷幅度）是未来方向，但设定适当幅度范围具有挑战性，因为测量的毒物兴奋效应依赖于研究设计和测量噪声。有些剂量-反应曲线在初始无反应区后显示J形，可能不属于当前分类，泛化分类或开发预处理流程可能改善检测。此外，未来方向包括扩展至简单化学混合物或时间效应，更高维的剂量-反应表面中某些切片可能具有毒物兴奋性，提示存在有益的成分比例。

最后，研究人员总结了结论：在本工作中，他们应用基于形状的统计检验SHARP，自动确定哪些植物成分或组成部分的剂量-反应曲线表现出毒物兴奋效应。在约5000条剂量-反应曲线中，约500条对J形显著，这被解释为毒物兴奋。这一数量与Tox21等剂量-反应数据库中隐藏的毒物兴奋行为估计一致。提出的方法已有效用于从大规模剂量-反应数据中筛选毒物兴奋效应，可视化方法有效促进了检验结果的验证和解释。