拉曼光谱用于纤连蛋白-5盆腔器官脱垂小鼠模型阴道组织改变的无损检测

《Biophotonics Discovery》：Raman spectroscopy for nondestructive detection of vaginal tissue alterations in the fibulin-5 murine model of pelvic organ prolapse

　　

实验工作流程示意图。处死后，取出生殖道并分离出阴道道（a.1）。将阴道组织从两侧修整，获得约5×5毫米的标本，该标本位于内侧腹侧壁中央，用于离体分析（a.2），然后使用便携式拉曼光谱系统对16个感兴趣区域进行探测（a.3）。随后对组织进行斑点标记，并进行平面双轴力学测试（a.4）。生物力学测试结束后，用组织墨标记标本方向（b.1），在10%中性缓冲福尔马林中固定24小时，然后浸泡在70%异丙醇中并储存在4°C。最后，将标本在横截面进行5微米连续切片并染色，进行组织学分析（b.2）。部分图形组件由BioRender制作。

发现声明

本研究结合拉曼光谱、组织学和生物力学测试，阐明了纤维连接蛋白-5敲除小鼠中盆腔器官脱垂的潜在光学生物标志物。这些技术的综合应用是建立临床可转化非侵入性工作流程以监测盆腔器官脱垂进展和治疗反应的关键第一步。

1. 引言

盆腔器官脱垂是一种因盆腔支持受损而表现为一个或多个盆腔器官从解剖位置下降的多因素疾病。1–4 大约50%的女性会出现某种程度的盆腔器官脱垂；然而，治疗手段仍不理想，在美国，超过30%的手术干预在2年后需要重新手术，非侵入性子宫托限制了日常活动。1,3,5,6 因此，盆腔器官脱垂可能对日常生活产生重大影响，导致泌尿和排便失禁、不适、尴尬、身体形象问题和性功能障碍。1–4,7 盆腔器官脱垂的病因仍不明确；然而，阴道细胞外基质成分的异常改变可能导致组织功能受损。收缩成分（如平滑肌细胞）与非收缩细胞外基质成分（包括胶原和弹性纤维）之间的相互作用决定了阴道的力学行为。8–10 证据表明，弹性纤维赋予弹性和顺应性，而胶原纤维提供抗张强度。9,11–13 承重细胞外基质成分浓度、排列和/或功能的变异可能损害阴道的力学和结构完整性；然而，成分与生物力学过程同盆腔器官脱垂之间的复杂关系尚未明确。阐明这些生化变化及其与组织功能的关系，可以为盆腔器官脱垂背景下阴道的组成-功能关系提供见解，从而为患者评估和治疗监测提供设计标准。

为此，先前文献指出弹性纤维组装失调，特别是弹性纤维结合蛋白纤维连接蛋白-5和赖氨酰氧化酶样蛋白1减少，与盆腔器官脱垂的发作和进展有关。14–23 事实上，纤维连接蛋白-5通过基质金属蛋白酶调控在机体免疫反应中发挥关键作用，其中重度盆腔器官脱垂女性的基质金属蛋白酶表达增加。24 当前研究盆腔器官脱垂病理生理学的其他改变的方法通常涉及组织切除，但活检具有侵入性、耗时，并可能进一步损害阴道完整性。小鼠模型为探索性研究提供了受控、经济且省时的替代方案。25 因此，纤维连接蛋白-5全局敲除小鼠是经过验证的弹性纤维发生失调模型，部分重现了人类盆腔器官脱垂的表现。19,26 先前的研究使用Fbln5?/?小鼠研究了血管、生殖器官和其他生物系统中的组成-功能关系。34–36 此外，Fbln5?/?小鼠在4至7周龄时即表现出弹性纤维畸形的明显迹象；然而，未生育小鼠直到生命晚期才表现出盆腔器官脱垂迹象。26,32 这为研究年龄作为盆腔器官脱垂病因成分提供了一个稳健且受控的框架。32

阴道在体内经历多轴加载。先前的研究指出盆腔器官脱垂导致阴道力学特性改变，导致结构完整性受损。18,37–40 此外，对阴道双轴力学行为的表征对于理解与盆腔器官脱垂和疾病进展相关的功能变化至关重要。平面双轴测试方案通过两个正交方向上独立的力传感器控制组织变形，从而实现组织各向异性的分析。41,42 在此，对方向依赖性形变阻力的定量及其相互作用提供了细胞外基质功能的关键见解。43–45 尽管双轴测试在盆腔组织中的使用日益增多，但脱垂小鼠阴道的各向异性力学特性尚未完全理解。

为阐明生化组成，拉曼光谱是一种化学特异性且非破坏性的光学技术，其中样品被近红外光激发以提取指示组成的实时分子指纹。拉曼光谱是用于组成分析的已验证工具，在结肠、主动脉、宫颈和其他器官中有生物医学应用。60,61 先前的研究将拉曼光谱与生物力学测试相结合，以改善对宫颈成熟过程中组成-功能关系的理解。57,62 这些证据表明，阴道组成的改变可能与盆腔器官脱垂相关的力学功能障碍相关；然而，关于阴道组成-功能关系存在重大知识空白。因此，将此方法与组织学验证和力学测试相结合将能够更深入地理解盆腔器官脱垂中的阴道。

本研究的目标是量化并关联野生型和Fbln5?/?小鼠的光学组成、被动生物力学和组织学观察。我们假设Fbln5?/?小鼠阴道的功能障碍是由于组织组成的改变，其中功能弹性纤维减少可能导致胶原相对浓度增加。18 此外，我们预期纤维连接蛋白-5的缺失将导致炎症特异性细胞外基质重塑和失调的组织代谢。15,16,20,63–68 如果成功，本研究将增进对盆腔器官脱垂病理生理学的理解，并具有将拉曼光谱工具转化为非侵入性细胞外基质监测的潜力。

2. 材料与方法

2.1. 动物使用和标本准备

本研究中所有小鼠均在22°C下适当饲养，在12小时光/暗周期下（0600至1800），可获取标准饲料和水（德克萨斯西南医学中心机构动物护理和使用委员会批准；临床试验编号：不适用）。24只未生育的C57BL/6J野生型和Fbln5?/?小鼠在发情期（20至26周龄；每基因型12只）被处死，并通过商业服务通过剪尾确认基因型（Transnetyx，美国田纳西州孟菲斯）。

按照既定方案测量小鼠盆腔器官脱垂量化评分。32 简要地说，在野生型和敲除小鼠上以毫米为单位测量会阴体长度和隆起大小，而阴道直径则记录是否存在足够的脱垂导致阴道口扩张。会阴隆起、宫颈下降和肛门脱垂分别按照序数尺度（0至4、0至3和0至2）进行分级，如前所述。32 小鼠盆腔器官脱垂量化评分为2或3的小鼠被纳入本研究的脱垂组，而评分为0或1的敲除小鼠被排除，以建立有害组织重塑的极端情况。18 所有野生型小鼠在进一步分析前均确认具有0分的小鼠盆腔器官脱垂量化评分，以排除潜在的混杂影响。

小鼠盆腔器官脱垂量化评估后，小鼠通过颈椎脱位安乐死，并立即切除阴道道[图1(a.1)]。在阴道背侧壁中线处切开，以暴露上皮，并从腹侧壁取出一块约5×5毫米的全厚度正方形标本，用于离体探头式拉曼光谱测试[图1(a.2)]。使用激光测厚仪在3×3网格中的9个感兴趣区域测量无载厚度并取平均值（野生型：0.205±0.08毫米，敲除型：0.221±0.11毫米，平均值±标准差）。

图1

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实验工作流程示意图。处死后，取出生殖道并分离出阴道道（a.1）。将阴道组织从两侧修整，获得约5×5毫米的标本，该标本位于内侧腹侧壁中央，用于离体分析（a.2），然后使用便携式拉曼光谱系统对16个感兴趣区域进行探测（a.3）。随后对组织进行斑点标记，并进行平面双轴力学测试（a.4）。生物力学测试结束后，用组织墨标记标本方向（b.1），在10%中性缓冲福尔马林中固定24小时，然后浸泡在70%异丙醇中并储存在4°C。最后，将标本在横截面进行5微米连续切片并染色，进行组织学分析（b.2）。部分图形组件由BioRender制作。

2.2. 拉曼光谱

本研究使用高通量光谱仪（HT3-SPEC-785，EmVision LLC，美国佛罗里达州洛亚哈奇）与冷却至-70°C的后照式深耗尽电荷耦合器件（PIXIS: 400BR，Teledyne Technologies，美国加利福尼亚州千橡市）结合使用，以实现最佳噪声抑制和量子效率。此外，使用了一种表面偏差（约300至600微米光学穿透）的定制拉曼探头，该探头具有七个300微米收集光纤围绕一个200微米激发光纤（EmVision LLC，美国佛罗里达州洛亚哈奇）。如前所述，69 收集几何结构包括在探头尖端处的抛光蓝宝石平凸透镜与1毫米厚的氟化镁光学窗口配对。785纳米激光器（I0785MM0350 MS-USB，Innovative Photonic Solutions Inc.，美国新泽西州普莱恩斯伯勒）的激发校准为探头尖端处80毫瓦功率，以优化信噪比，同时避免组织损伤，如小鼠宫颈出版物中所述。57 每次系统启动时，绝对波数轴使用霓虹-氩灯进行校准，并使用未涂层的扑热息痛片剂的光谱和萘石英比色皿精确计算拉曼位移。70 基于100微米狭缝规范的光谱仪光谱分辨率约为8 cm?1，使用霓虹-氩光谱发射线的半峰全宽进行了确认。使用国家标准和技术研究院标准参考物质的光谱进行了光谱响应校正（SRM2241，NIST，美国马里兰州盖瑟斯堡）。

在标本切除后立即[图1(a.1)-1(a.2)]，在上皮上采集16个拉曼光谱测量的网格[每个网格点10次重复的250毫秒曝光；图1(a.3)]。一个敲除标本在进行拉曼光谱测量前进行了斑点标记，随后被排除在拉曼光谱数据分析之外。光谱预处理包括使用七阶多项式拟合算法进行生物荧光和背景减法，以及使用Savitzky-Golay滤波器进行光谱噪声平滑。56,57,59,62,71,72

2.3. 拉曼光谱数据分析

在进行曲线下面积标准化之前，将预处理后的光谱按每个网格点平均以提高信噪比。对于光谱分析，将样本中所有16个网格点平均以提供每个样本的合并特征。单个高斯分布拟合在1003 cm?1苯丙氨酸和1101 cm?1桥连素/异桥连素峰上以提取位置、强度和曲线下面积，而在酰胺I带（1590至1720 cm?1）和酰胺III带（1230至1300 cm?1）下拟合多个曲线（高斯混合）以进行完整的峰值分析，如表1和补充材料中的图S1所示。73

表1

特征拉曼峰和峰解卷积的暂定分配。

峰（cm?1） 暂定分配 来源
1003 苯丙氨酸的C─C芳香环呼吸 55, 73–79
1101 弹性纤维中桥连素和异桥连素交联氨基酸 79–81
1246 通常与胶原相关的酰胺III模式 56, 59, 75, 78, 82, 83
1300 脂质的CH2/CH3扭曲 57, 59, 75, 77, 79, 84, 85
1654（宽） 酰胺I蛋白α螺旋二级结构 55, 59, 74, 75, 79, 86, 87

宽，宽带。

对于监督的高级生化分析，如前所述，进行非负最小二乘回归以阐明纯组分对实验测量的光谱贡献。56,57,59,62 除非另有说明，所有纯组分均购自MilliporeSigma（美国马萨诸塞州伯灵顿）。采集并处理以下纯粉末形式的光谱：雌二醇（人，PHR1353）、糖原（牛肝，G0885）、反渗透水、胆固醇（羊毛，C8667）、弹性蛋白（牛颈韧带，E1625）、胶原I（鼠尾，C7661）、透明质酸（酸形式，935166）、肌动蛋白（兔肌肉，A2522）、孕酮（合成，P0130）和磷脂酰胆碱（蛋黄，P3556），按照相同的实验方案进行处理。使用70/30乙醇溶液在测量之间清洁探头；因此，乙醇也被添加到模型中以考虑潜在的信号污染。为满足非负最小二乘假设的输入变量独立性，对纯光谱进行了Spearman相关分析，相关性ρ≥0.65的移除了一个组分62（补充材料中的图S2）。最终模型包括胶原I（代表细胞外基质蛋白肌动蛋白、弹性蛋白和胶原I和III）、雌二醇、孕酮、水、胆固醇、糖原、乙醇和脂质（磷脂酰胆碱）（补充材料中的图S3）。如前所述，进行非负最小二乘回归分析以计算八个纯组分对实验光谱的贡献。56,57,59,62 非负最小二乘模型的输出随后归一化为每个光谱的总系数百分比，称为非负最小二乘分数，以便于比较。

2.4. 生物力学测试和分析

在拉曼光谱测量后，所有样品均涂有黑色印度墨以进行光学变形追踪（每基因型12个样本）[图1(a.4)]。

随后将组织浸入Hank's平衡盐溶液中，并安装于双轴拉伸仪（BioTester 5000，CellScale，加拿大安大略省滑铁卢）上，该设备配备两个5N载荷传感器（分辨率：±5 mN）。分别在环向和纵向记录未加载的夹具间距长度，然后施加10 mN的预载荷，以确保在双轴测试前样本处于绷紧状态。随后对组织进行五轮预条件处理，以确保一致且可重复的力学响应，之后进行10分钟的平衡期，以确保结果的一致性和可重复性。最后，对试样进行三种位移控制方案的双轴加载测试，环向（θ）与纵向（z）位移比分别为1:1、1:0.5和0.5:1，最大位移值为12%，进行五个加载-卸载循环。θ:z比为1:1表示等双轴方案，即在两个加载方向上均有12%的最大位移；而θ:z比为1:0.5表示环向最大位移为12%，纵向为6%。三种方案的最后一次加载循环用于数据分析，其中评估了各向异性和方向依赖的组织特性，并拟合Fung本构模型。使用基于MATLAB的数字图像相关框架来量化样本变形。

2.5. 组织学

生物力学测试后立即，在远端（最靠近阴道口）用墨水标记组织以确定方向，将其放入组织盒中，在室温（22°C）下用10%中性缓冲甲醛固定24小时。24小时后，将组织转入70%异丙醇溶液，并储存在4°C易燃冰箱中，直到收集所有样本。随后将组织送交德州大学西南医学中心组织病理学核心实验室，按照标准程序进行固定后石蜡组织学处理和染色。简要过程如下：样本经过脱水、透明后嵌入石蜡中，在阴道横切面上以5 μm厚度连续切片，使用旋转刀片切片机（RM2255 Microtome，Leica Camera，德国威茨拉尔）。连续切片后，使用苏木精-伊红染色（H&E，蓝色/紫色——细胞核，粉红色/红色——细胞外基质）、改良Hart弹性蛋白染色（紫色/黑色——成熟、功能性弹性纤维）、Masson三色染色（MTC，黑色——细胞核，红色——细胞质，蓝色/绿色——胶原蛋白），或Alcian蓝/高碘酸-Schiff联合染色（AB-PAS，蓝色——酸性碳水化合物，粉红色/红色——中性碳水化合物），按照既定方案进行染色。

组织学切片使用明场照明、20倍物镜成像（SLIDEVIEW VS200，Evident，日本东京），并在Fiji中进行分析。图像进行白平衡校准，每个组织识别三个感兴趣区域。处理后，两个样本（n=1/基因型）因与组织学分析不兼容而被剔除。使用颜色阈值法和二值化处理分离成熟、功能性弹性纤维（染成紫色/黑色），采用针对Fiji实验室修改的既定方案。成熟、功能性弹性纤维的面积分数计算为：超过阈值的像素数除以Hart弹性蛋白切片中上皮下层和肌层中所有像素的总数。同样，从MTC切片上的上述感兴趣区域中提取上皮厚度和上皮下层/肌层合并厚度，使用实验室修改版的ThicknessTool ImageJ插件（补充材料图S5）。最后，使用Fiji的Colour Deconvolution插件将AB-PAS染色切片解卷积为红色、绿色和蓝色通道，红色通道与蓝色通道的强度比用于分别表示中性碳水化合物与酸性碳水化合物的比率（补充材料图S6）。

2.6. 统计分析

所有统计分析在RStudio（R 4.4.2）中进行。16个拉曼光谱测量点的网格值按每个试样取平均，用于所有统计比较。使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验分别评估数据的正态性和方差齐性。使用双侧Wilcoxon秩和检验比较严重脱垂组织敲除小鼠（KO，MOPQ=2/3）与非脱垂野生型小鼠（WT，MOPQ=0）之间的RS特征和Fung本构模型参数，但糖原NNLS评分、组织学中性与酸性碳水化合物比、组织学弹性纤维面积分数以及I????/I????峰值比除外，这些参数采用单侧检验，因为我们假设这些参数会如先前文献所述随POP下降。在生物力学参数、RS特征和组织学输出之间进行Spearman相关性分析，以阐明与疾病严重程度相关的潜在光学生物标志物。

3. 结果

3.1. 拉曼光谱

Wilcoxon秩和检验发现与几种ECM成分相关的峰参数存在显著差异。在敲除组中，交联弹性纤维与ECM蛋白的峰值比I????/I????（p=0.015）相比野生型同窝小鼠显著降低。相反，脂质与蛋白比I????/I????（p=0.019）和1003 cm?1 AUC（p=0.027）在敲除组中相比野生型对照组显著升高。

拉曼光谱的峰值分析表明，敲除阴道与对照组相比存在显著变化。交联弹性纤维与ECM蛋白的峰值比I????/I????（a）显著降低，而脂质与蛋白的峰值比I????/I????（b）和1003 cm?1 AUC（c）在敲除小鼠（KO，MOPQ=2/3，紫色，n=11）中相比野生型同窝小鼠（WT，MOPQ=0，绿色，n=12）显著升高。暂定峰归属见表格1。每个切除的（5×5 mm）阴道腹侧壁以网格格式进行16次RS测量，结果取平均为每只小鼠一个数据点。箱线图数据以均值±四分位距表示。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05表示统计显著性。一个敲除样本在RS测量前进行了散斑涂覆，因此被排除在此部分分析之外。

使用有监督NNLS算法量化实验光谱中纯组分的浓度，作为峰解卷积的补充。与野生型组织相比，敲除阴道中胆固醇（p=0.0086）和孕酮（p=0.015）的NNLS评分显著升高。糖原NNLS系数在敲除小鼠中相比野生型同窝小鼠显著降低（p=0.022）。两组之间的胶原蛋白NNLS系数无显著差异（p=0.069）。此外，水、雌二醇或脂质含量的NNLS系数未发现显著差异。

拉曼光谱的NNLS分析表明，敲除阴道与对照组相比存在显著变化。与野生型（WT，MOPQ=0，绿色，n=12）对照相比，敲除小鼠（KO，MOPQ=2/3，紫色，n=11）中胆固醇（a）和孕酮（b）的NNLS评分升高，而糖原NNLS评分（c）降低。或者，胶原蛋白NNLS评分（d）在两组之间无显著变化。每个切除的（5×5 mm）阴道腹侧壁以网格格式进行16次RS测量，结果取平均为每只小鼠一个数据点。箱线图数据以均值±四分位距表示。**p<0.01，*p<0.05表示统计显著性。一个敲除样本在RS测量前进行了散斑涂覆，因此被排除在此部分分析之外。

3.2. 生物力学

与野生型组织相比，敲除组织表现出方向依赖性的力学响应改变，具体而言，敲除组织表现出环向延展性降低和纵向延展性增加。在野生型组织中，纵向比环向更硬；然而，这种方向性关系在敲除组中反转了。

野生型（WT，MOPQ=0，绿色圆圈）和敲除（KO，MOPQ=2/3，紫色方块）小鼠阴道的环向（a）和纵向（b）应力-应变曲线（n=12/组）。黑色箭头表示敲除组织的环向延展性降低且纵向延展性增加，与野生型相比。数据以均值±标准误表示。

阴道组织在不同双轴位移比下表现出非线性力学行为响应。此外，Fung本构模型生成了合理的R2值，确认了对野生型和敲除阴道非线性生物力学响应的可接受模型描述。材料参数φ在敲除组织中显著降低（p=0.011），与野生型同窝小鼠相比，表明各向异性或方向依赖性增加。其他Fung参数未达到统计显著性；然而，暂定定义为组织在环向方向上抵抗形状改变的c?，在敲除组中视觉上升高（p=0.11）。c?（p=0.16）（组织在纵向方向上抵抗形状改变）、c?（p=0.41）（加载期间环向与纵向方向的机械交互）和k（p=0.63）（整体形状改变阻力）参数在敲除阴道中视觉上低于野生型同窝小鼠。

根据Fung本构模型计算的机械参数，其中材料参数k（a）、c?（b）、c?（c）或c?（d）未发现显著差异；然而，各向异性指数（φ）在敲除小鼠（KO，MOPQ=2/3，紫色）中相比野生型同窝小鼠（WT，MOPQ=0，绿色）显著降低（n=12/组）（e）。箱线图数据以均值±四分位距表示。*p<0.05表示统计显著性。

表2 野生型和敲除阴道样本中小鼠阴道组织的Fung本构模型参数和各向异性指数的均值和标准差。

基因型 | 模型参数 | 各向异性指数（φ）
k (kPa) | c? (?) | c? (?) | c? (?) | R2
野生型 | 均值 | 17.00 | 96.39 | 43.47 | 26.55 | 0.88 | 0.52
| 标准差 | 29.56 | 54.81 | 30.87 | 18.09 | 0.21 | 0.21
敲除 | 均值 | 6.40 | 150 | 25.43 | 19.88 | 0.98 | 0.31
| 标准差 | 6.90 | 81.48 | 14.37 | 13.54 | 0.01 | 0.20
p值 | 0.629 | 0.114 | 0.160 | 0.409 | 0.011
**p<0.05表示统计显著性。

3.3. 组织学

组织学染色显示敲除组和野生型阴道腹侧之间存在明显差异。中性与酸性碳水化合物的比值（从AB-PAS染色的红色与蓝色通道强度比计算得出，p=0.028）以及成熟、功能性弹性纤维的面积分数（p<0.0001）在敲除组中相比野生型同窝小鼠显著降低。其他组织学或激光测微仪比较未发现组织厚度存在显著差异。

敲除和对照阴道组织的代表性组织学图像。野生型（a、c、e、g）和敲除（b、d、f、h）阴道样本的横截面组织学感兴趣区域。H&E（a、b）染色细胞核（蓝色/紫色）和细胞外基质（粉红色/红色）。MTC（c、d）染色切片用于区分组织层（m——肌层，s——上皮下层，e——上皮）并显示细胞核（黑色）、细胞质（红色）和胶原蛋白（蓝色/绿色）。弹性纤维可视化，改良Hart方案（e、f）染色成熟、功能性弹性纤维（紫色/黑色，由蓝色轮廓箭头指示）。联合AB-PAS（g、h）染色中性碳水化合物（粉红色/红色）和酸性碳水化合物（蓝色）。比例尺100 μm。

AB-PAS染色样本的组织学分析表明存在与脱垂相关的变异；然而，组织学测量的厚度值无差异。中性与酸性碳水化合物比值（a）在敲除小鼠（KO，MOPQ=2/3，紫色）中相比野生型同窝小鼠（WT，MOPQ=0，绿色）显著降低（n=11/组）。或者，上皮厚度（b）和上皮下层-肌层合并（S-M）厚度（c）（以微米为单位）在敲除和野生型阴道样本之间无差异。箱线图数据以均值±四分位距表示。*p<0.05表示统计显著性。两个样本（n=1/基因型）因与组织学分析不兼容而被剔除。

野生型（a、b）和敲除（c、d）阴道样本的代表性阴道切片。切片使用Hart弹性蛋白染色（a、c），然后成像处理以分离成熟、功能性弹性纤维（b、d），并计算弹性纤维面积分数为上皮下层和肌层的百分比。与野生型（WT，MOPQ=0，绿色）相比，敲除小鼠（KO，MOPQ=2/3，紫色）中弹性纤维面积分数显著降低（n=11/组）（e）。箱线图数据以均值±四分位距表示。****p<0.0001表示统计显著性。比例尺100 μm。两个样本（n=1/基因型）因与组织学分析不兼容而被剔除。

3.4. 多模态相关性分析

Spearman相关性分析显示，I????/I????交联弹性纤维与ECM蛋白峰值比与组织学鉴定的成熟、功能性弹性纤维面积分数之间存在统计学显著的正相关关系（p=0.0159，ρ=0.53）。凸出大小（毫米，凸出越大表示POP表现越严重）与组织学测量的成熟、功能性弹性纤维面积分数之间也存在显著负相关（p=0.0001，ρ=-0.74）。

Spearman相关性分析的变量配对散点图。

拉曼光谱计算的交联弹性纤维与 ECM 蛋白峰比（??1101/??1654）与改良 Hart 弹性染色显示的成熟、功能性弹性纤维面积分数呈正相关（a）；然而，对于野生型（WT，MOPQ=0，绿色圆圈，n=11）和基因敲除型（KO，MOPQ=2/3，紫色方块，n=10?–11?）小鼠，膨出大小与成熟、功能性弹性纤维面积分数之间存在显著负相关关系（b）。每块切除的（5×5 mm）阴道腹壁均按照网格格式进行 16 次拉曼光谱测量 [图 1(a.3)]，并将结果取平均值为每只小鼠的一个数据点。一个基因敲除标本在拉曼光谱测量前进行了散斑涂层处理，因此未包含在（a）图中。两个样本（n=1/基因型）因不适用于组织学分析而被省略。?表示（a）图的样本量，?表示（b）图的样本量。

4. 讨论与结论

盆底器官脱垂（POP）的病因至今仍广泛未知且研究不足；然而，我们假设 ECM 失调可能会导致组织功能受损。目前，在不采用侵入性和破坏性方法的情况下，组织评估工具有限；因此，本研究使用拉曼光谱（RS）、平面双轴和组织学方法，评估了基因敲除和同龄野生型小鼠阴道的生物化学和生物力学特性。此外，多种互补方法之间的相关性分析加强了拉曼光谱成分测量作为组织顺应性改变时生物力学变化的潜在替代物或预测指标的研究发现。

4.1. 光学成像识别了脱垂小鼠阴道 ECM 含量的变化

众所周知，在 ????????????5?/? 小鼠模型中，弹性纤维组装不正确；因此，我们假设与野生型同胞相比，基因敲除小鼠中功能性弹性纤维的相对含量会减少。9,18,26–28 支持我们假设的是，非破坏性拉曼光谱方法显示，与野生型同胞相比，基因敲除小鼠的 ??1101/??1654 峰强度比显著降低，该比值代表交联弹性纤维的光学浓度相对于 ECM 蛋白含量的比例 [图 2(e)]。在人皮肤中，拉曼光谱将机械变形增加与 ??1101 降低联系起来，突出了拉曼光谱对弹性纤维负载变化以及成熟、功能性弹性纤维形成的潜在敏感性。100 对 ??1101/??1654 比值的特定分析显示，与野生型对照组相比，基因敲除小鼠阴道中的拉曼峰 ??1101 显著降低（补充材料图 S11B）；然而，指示蛋白二级结构和丰富程度的 ??1654 没有显著变化（补充材料图 S11C）。验证我们的光学发现，与野生型同胞相比，基因敲除小鼠的 Hart 弹性面积分数显著降低（图 8），并且与非破坏性 ??1101/??1654 拉曼光谱特征 [图 9(a)] 以及 MOPQ 测量会阴膨出高度 [图 9(b)] 呈正相关。先前关于弹性酶对 Hart 弹性染色影响的小鼠阴道研究发现，随着弹性纤维降解，面积分数降低，表明组织学对功能性弹性纤维具有敏感性。11 此外，本文报道的基因敲除小鼠中功能性弹性纤维面积分数的降低与先前关于 ????????????5?/? 阴道18 和主动脉34 的文献报道一致。将组织学弹性纤维面积分数与 ??1101/??1654 峰比相关联，可能允许对脱垂进展过程中的弹性纤维完整性进行无创监测。

为了测试我们关于胶原蛋白可能补偿阴道中功能性弹性纤维减少的假设，我们研究了 1003 cm?1 苯丙氨酸拉曼峰。这种模式在许多 ECM 蛋白中持续存在；然而，先前的文献主要将 1003 cm?1 峰归因于胶原蛋白，因为苯丙氨酸是胶原蛋白纤维合成的前体氨基酸。83,101,102 此外，阴道 ECM 主要以胶原蛋白为主，伴有适量的弹性纤维和光滑肌，表明这种苯丙氨酸模式很可能代表光学胶原蛋白含量。103 假设 1003 cm?1 拉曼峰在温度和蛋白构象改变时保持相对不变，通常用作光谱归一化的内部标准；104,105 然而，本文报告的 1003 cm?1 AUC 在基因敲除小鼠中与其野生型同胞相比显著增加 [图 2(c)]。这可能表明胶原蛋白数量增加，以克服因 fibulin-5 缺乏而导致的功能性弹性纤维缺失；然而，光谱解混模型并未证实这一点，因为 NNLS 胶原蛋白评分在基因敲除小鼠中与其野生型同胞相比呈下降趋势 [图 3(d)]。这一结果令人惊讶；然而，这可能与使用胶原蛋白 I 作为所有 ECM 成分（包括弹性蛋白、肌动蛋白以及胶原蛋白 I 和 III）的代表分子有关，这是由于 NNLS 算法关于输入变量多重共线性的局限性所致（补充材料图 S2 和 S3）。涉及组织重塑的特定胶原蛋白类型的改变可能进一步导致 NNLS 胶原蛋白结果不显著。18 此外，与野生型同胞相比，基因敲除阴道组织表现出周向延展性降低 [图 4(a)] 但纵向延展性增加 [图 4(b)]。这些形状变化阻力的视觉改变可能与胶原蛋白交联、取向和/或类型增加有关；然而，需要更多研究来阐明胶原蛋白与 POP 之间的具体微观结构关系。41,106

4.2. 基因敲除阴道表现出 ECM 蛋白组织异常迹象

小鼠阴道表现出与其他软生物组织一致的非线性且方向依赖的应力 - 拉伸响应；然而，与野生型同胞相比，基因敲除阴道表现出相反的方向延展性（图 4）。40,42,43,107 已有充分记录表明，组织成分直接影响其生物力学功能，其中弹性纤维允许回弹和恢复，而胶原蛋白提供阴道的抗拉强度。8–10 实施的 Fung 模型允许在基因敲除和野生型小鼠之间对计算的材料参数进行稳健比较（补充材料图 S8-S9）。在此，我们将材料参数解释如下：??1 和 ??2 可能分别代表组织对周向和纵向变形的阻力，而 ??3 可能表征这些方向之间的机械相互作用。45,88 参数 ?? 反映组织对形状变化的整体阻力。45,88 这些模型参数在各组之间没有显著差异 [图 5(a)–5(d)]；然而，计算出的各向异性指数 ??（即周向和纵向方向对组织形状变化阻力的贡献）在基因敲除组中与其野生型同胞相比显著降低 [图 5(e)]。我们的成分和组织学分析没有提供直接的相关性来解释这种行为，表明需要额外工具来评估 ECM 结构和组织，以提供方向依赖特性的见解。值得注意的是，静止阴道构型类似于折叠的圆柱体。108 在 ????????????5?/? 小鼠中，POP 表现为子宫宫颈和阴道下降，导致常规塌陷腔体扩张以容纳移位的器官，并从根本上改变阴道负载条件。19 此外，在估计的生理压力下，????????????5?/? 阴道处于更高的生物力学应力状态。18,22 因此，我们的结果可能表明基因敲除阴道中存在方向偏好增加和潜在的补偿机制，其中 ECM 进行重塑和重新排列，作为对抗变形增加的防护措施。

4.3. 基因敲除小鼠阴道中的组织重塑受损

除了承重成分的变化外，我们假设由于 fibulin-5 在 MMP 调节中的作用，存在炎症性 ECM 改变。15,16,20,63–65 具体来说，MMP-9 是参与慢性炎症相关 ECM 降解的已知成分，在 POP 小鼠阴道中增加。15,66–68 人体的免疫反应很复杂，招募多种生物成分，可能导致脂质代谢失调。109 在这方面，暂时鉴定为脂蛋白比的 ??1300/??1246 峰比在基因敲除小鼠阴道中与其野生型同胞相比增加 [图 2(b)]。脂质是阴道的关键成分，有助于 ECM 稳态，其中病理性过程，如炎症，会改变总脂质含量。110,111 在患有外阴阴道念珠菌病和细胞溶解性阴道炎的患者中，与细胞凋亡和慢性炎症相关的脂质浓度增加，如磷脂和棕榈酸，表明脂质谱与病理性阴道微环境破坏之间可能存在关系。111 对 ??1300/??1246 峰比的深入分析显示，基因敲除小鼠中的 ??1300 脂质峰显著增加（补充材料图 S11C）；然而，与野生型同胞相比，基因敲除小鼠中的 ??1246 蛋白峰没有观察到变化（补充材料图 S11B）。支持这一发现，基因敲除小鼠中的胆固醇 NNLS 评分显著高于其野生型同胞 [图 3(a)]。失调的细胞胆固醇代谢与各种器官系统的病理状况有关，如帕金森病，112,113 系统性红斑狼疮，114 和癌症115，其中 MMP 增加表明炎症。116 阴道液中的胆固醇含量已知随月经周期波动；然而，本研究中使用的小鼠均在动情期处死。117 因此，基因敲除小鼠中胆固醇 NNLS 评分的增加可能表明胆固醇代谢失调和 POP 相关炎症增加，可能与 ECM 重塑受损有关。

糖原是用于葡萄糖储存和组织修复的多糖，在肝脏和骨骼肌中含量高；然而，它也存在于其他组织中。118 激素被认为影响管腔糖原沉积，其中糖原含量在更年期母绵羊99 和人119 阴道以及生殖衰老小鼠子宫中显著降低。62 在这方面，基因敲除小鼠中的糖原 NNLS 评分与其野生型同胞相比显著降低 [图 3(b)]。支持无标签拉曼光谱结果，中性（粉/红，糖原）与酸性（蓝）碳水化合物比值（从 AB-PAS 染色小鼠阴道组织的组织学分析中提取）在基因敲除小鼠中与其野生型同胞相比降低 [图 7(a)]。阴道产生和储存糖原以增强上皮屏障防御，并为上皮下和肌层提供细胞营养。120–122 先前关于肺纤维化的文献报告称，病变成纤维细胞中糖原合成和降解增加，这可能表明 ECM 纤维沉积与糖原耗竭之间存在相关性。123 在此，我们假设与野生型同胞相比，基因敲除小鼠阴道中观察到的糖原含量降低可能与 ECM 重塑失调有关；然而，需要对糖原对 POP 阴道的进一步影响进行研究。

孕酮是卵巢产生的性激素，对阴道组织稳态至关重要。124,125 已知孕酮水平与卵巢切除大鼠阴道上皮细胞表型变化有关，并对小鼠宫颈组织硬化和 ECM 重塑产生影响。124,125 在此，基因敲除小鼠阴道中的孕酮 NNLS 评分与其野生型同胞相比显著增加 [图 3(b)]。先前关于小鼠宫颈的研究将孕酮处理与 Col1A1 和 Eln 表达以及 ECM 微观结构联系起来。125 在此，孕酮 NNLS 评分增加可能与各向异性指数（??）降低有关，其中升高的孕酮含量可能改变胶原蛋白纤维对齐方式，正如先前在小鼠宫颈中所展示的那样。125 众所周知，全身性类固醇激素在小鼠动情周期阶段之间和内部波动。126 具体来说，孕酮和雌激素从早期到晚期动情期呈下降趋势，这可能有助于观察到的差异；然而，????????????5?/? 小鼠全身性和组织水平性激素含量的变化仍未知。本研究中使用的动物均为同龄并在动情期处死，以控制全身激素谱；然而，该模型中特定基因型的类固醇激素水平差异仍未定义。未来的研究应实施额外方法，如类固醇免疫测定或液相色谱 - 串联质谱，以阐明全身性和局部孕酮和雌激素对 ????????????5?/? 小鼠阴道 ECM 组织、成分和功能的影响，以辨别激素对 POP 表现的影响。127

4.4.

### 3.3 衰老

尽管雌激素缺乏被认为是 POP 的潜在促成因素，且衰老本身也被认为是 POP 的一个独立危险因素125,126，但目前仍不清楚 POP 相关的组织变化是否独立于衰老而发生。127 为探究衰老是否驱动 POP 相关的组织改变，我们比较了 4 个年龄组的野生型（WT）母鼠与 Fbln5?/? 母鼠。

衰老相关的 POP 危险因素包括年龄、产次和体重指数。128,129 我们选择年龄，而非产次或体重，作为衰老研究的关键变量，是因为该模型在产次和体重方面存在固有差异（见方法部分）。15

### 3.3.1 年龄与阴道组织厚度、组织成分及组织力学特性

4 个年龄组中 Fbln5?/? 与 WT 之间阴道壁厚度的差异具有统计学意义（*p* < 0.01），表明年龄本身并非该模型中阴道壁厚度变化的唯一变量。Fbln5?/? 阴道壁厚度从 2 个月时的 473 μm（± 53）增至 4 个月时的 800 μm（± 102），而 WT 从 359 μm（± 41）增至 682 μm（± 58）。在 4 个年龄组中，Fbln5?/? 阴道壁厚度均大于同龄 WT（图 5(a)），与既往报道一致。15,18,22

4 个年龄组中均观察到随年龄增长，阴道组织发生生化成分变化。15,16,18,19,22,23 这些结果在 Fbln5?/? 组与 WT 组中均一致，表明该模型中 POP 的发生可能并未显著改变阴道组织成分。

### 3.3.2 年龄与阴道组织厚度、组织成分及组织力学特性的关系

### 3.3.3 年龄与阴道组织厚度、组织成分及组织力学特性的关系

*（原文此处标题重复，译文保留）*

### 4.4 衰老并非 POP 相关的组织改变（阴道壁厚度）的原因

POP 的主要临床危险因素之一是生理年龄，而生理年龄又与绝经发生（即卵巢功能停止、导致雌激素全身性下降）相互混杂。128,129 然而，关于绝经与 POP 关系的研究结果相互矛盾：部分研究报道绝经与 POP 严重程度之间存在直接关联，40,130,131 而其他研究则认为两者无显著相关性。132 超过 50% 的绝经后女性会经历绝经期泌尿生殖综合征，包括因雌激素降低导致的阴道壁萎缩和炎症。129 生理年龄与激素状态之间的多重共线性可能解释了这些相互矛盾的报告：萎缩是伴随衰老出现的绝经症状，132–134 而 POP 的主要危险因素则是年龄本身。128,135 此外，在绵羊绝经模型中，阴道壁变薄与糖原含量降低直接相关；然而，在 Fbln5?/? 小鼠的文献中，与野生型对照相比，敲除鼠阴道壁厚度并无显著差异。18,99 小鼠是衰老研究的成熟且可靠的选择，因其寿命相对较短；但小鼠并不会随年龄自然经历与人绝经相当的激素变化。136,137 因此，与野生型同胞鼠相比，未检测到敲除鼠阴道壁厚度存在显著差异[图 7(b)–7(c) 及补充材料图 S10]。这些结果可能提示，在 Fbln5?/? 小鼠 POP 模型中，阴道萎缩与 POP 是两个独立事件，均伴随生理年龄增长而发生。未来需要通过切除双侧卵巢诱导绝经，在 Fbln5?/? 小鼠中开展研究，以便将激素降低与年龄因素加以解耦。

### 4.5 实验局限与未来方向

尽管本研究尽力控制了相关变量，但仍存在局限。虽然小鼠是有效的实验模型，但其生殖器官的载荷条件与双足行走的人类不同。此外，Fbln5?/? 小鼠会随生理年龄自发出现脱垂，且与产次无关；而在女性中，危险因素是多方面且复杂得多的。19,128 本研究使用了先前报道的 C57BL/6J 小鼠品系，其预期为 Fbln5?/? 基因型并具有类似的表型。138 其他研究则基于 C57BL/6 × 129SvEv 遗传背景，15,16,18,19,22,23,26,139 这可能是所观察差异的来源之一。尽管如此，该小鼠模型可在数月的时间内（相比人类需数年）评估 POP 病理生理的生化与生物力学特征，同时提供组织样本并允许每次隔离一个混杂因素。

本研究的另一局限在于用于拉曼光谱解卷积的 NNLS 算法：输入变量相互独立的假设将生化组成相似的纯组分从模型考虑中排除。此外，输入变量对模型中每个纯分量的形状进行约束，阻碍了对伴随蛋白质变性和微结构变化的线形等细微光谱变化的深入分析。140 尽管并非 POP 中 ECM 变化的精确描绘，NNLS 模型仍是峰解卷积的互补方法，是理解脱垂相关阴道生化变化的关键第一步。此外，本文呈现的组织学结果对部分 NNLS 建模结果提供了正交支持；然而，验证脂质含量等额外模型成分的未来工作将需要低温保存方案。未来研究需探索能够包含并区分相关 ECM 成分的其他光谱建模方法，以改善可解释性并辅助治疗研究。

本研究是在 Fbln5?/? 小鼠模型中对 POP 进行无创光学表征的关键第一步。此外，本研究在动物 POP 模型中长期监测方面显示出显著的转化潜力；然而，仍需更多研究以确定测量结果相对于完整小鼠解剖结构与当前 RS 探针设计的情况。此外，对小鼠阴道空间变异性的研究可能为 POP 病理生理提供关键洞见。所提出的技术可作为临床早期诊断工具，在症状显现之前，将成分的**光学生物标志物**与该疾病的**成分-功能关系**相关联。

总之，本研究在 POP 敲除小鼠模型中量化了生化、组织学与生物力学变化，并将其与同龄野生型同胞鼠进行比较。这些组织 ECM 成分的非破坏性、无标记测量在 POP 小鼠模型中与组织学特征相关。此外，我们展示了一条已建立并经验证的非破坏性成分分析工作流程，对未来无创临床 POP 评估与治疗监测具有重要意义。未来方向将把该研究扩展至人体受试者以进行技术验证，从而确立该方法作为患者组织评估可行临床工具的地位。

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### 3.3 Aging

Although estrogen deficiency is considered a potential contributing factor to POP and aging itself is considered an independent risk factor for POP, 125,126 it remains unclear whether POP-associated tissue changes occur independently of aging. 127 To investigate whether aging drives POP-related tissue alterations, we compared WT and Fbln5?/? sows across four age cohorts.

Age-related risk factors for POP include age, parity, and body mass index. 128,129 We selected age, rather than parity or body weight, as the key variable for the aging study because parity and body weight present inherent differences in this model (see Methods). 15

### 3.3.1 Age and vaginal tissue thickness, composition, and biomechanics

Statistically significant differences in vaginal wall thickness between Fbln5?/? and WT were observed across all four age cohorts (*p* < 0.01), indicating that age alone is not the sole variable driving changes in vaginal wall thickness in this model. Fbln5?/? vaginal wall thickness increased from 473 μm (± 53) at 2 months to 800 μm (± 102) at 4 months, whereas WT increased from 359 μm (± 41) to 682 μm (± 58). Fbln5?/? vaginal wall thickness was greater than that of age-matched WT across all four cohorts (Fig. 5(a)), consistent with prior reports. 15,18,22

Biochemical changes in vaginal tissue with age were observed across all four cohorts. 15,16,18,19,22,23 These results were consistent between the Fbln5?/? and WT groups, suggesting that POP onset may not significantly alter vaginal tissue composition in this model.

### 3.3.2 Age and vaginal tissue thickness, composition, and biomechanics

### 3.3.3 Age and vaginal tissue thickness, composition, and biomechanics

*(The heading is repeated in the source; retained here for fidelity.)*

### 4.4 Aging is not the cause of POP-related tissue change (vaginal wall thickness)

One of the major clinical risk factors of POP is chronological age, which is confounded by the onset of menopause, or the cessation of ovarian function that leads to systemic estrogen decline. 128,129 However, studies relating menopause and POP are conflicting, with some reporting a direct association between menopause and POP severity, 40,130,131 whereas others claim no significant correlation. 132 Upwards of 50% of postmenopausal women experience genitourinary syndrome of menopause, including vaginal wall atrophy and inflammation as a result of decreased estrogen. 129 The multicollinearity between chronological age and hormonal status may contribute to these conflicting reports, as atrophy is a symptom of menopause which occurs with aging, 132–134 whereas a major POP risk factor is age itself. 128,135 Further, vaginal wall thinning in an ewe model of menopause directly correlates to decreasing glycogen content; however, literature in the Fbln5?/? mouse reports no significant differences in the knockout vaginal wall thickness when compared with wildtype controls. 18,99 Mice are a well-established and robust option for age-related studies due to their comparatively short lifespan; however, they do not naturally experience a hormonal equivalent of human menopause with age. 136,137 To this end, no significant differences were detected in the knockout vaginal wall thickness when compared with their wildtype littermates [Figs. 7(b)–7(c) and Fig. S10 in Supplementary Material]. These results may indicate that vaginal atrophy and POP are separate events that each co-occur with increased chronological age in the Fbln5?/? murine POP model. Future research in the Fbln5?/? mouse wherein menopause is induced via ovariectomy is needed to enable the decoupling of hormone reduction and age.

### 4.5 Experimental Limitations and Future Directions

Despite efforts to control relevant variables, this study was not without limitations. Although the mouse is an effective laboratory model, the loading conditions of the reproductive organs are different than in the bipedal human. In addition, the Fbln5?/? mouse spontaneously develops prolapse as a function of chronological age and regardless of parity; however, in women the risk factors are multifaceted and much more complex. 19,128 This study used a previously reported C57BL/6J mouse lineage with expected Fbln5?/? genotype and analogous phenotype. 138 Additional studies were based on the C57BL/6 × 129SvEv background, 15,16,18,19,22,23,26,139 which may contribute to observed differences. Nevertheless, this murine model allows for the evaluation of biochemical and biomechanical aspects of POP pathophysiology in months compared with years in humans while providing access to tissue samples and permitting isolation of one confounding factor at a time.

Another limitation of this study was the NNLS algorithm for Raman spectral unmixing, as the assumption of input variable independence eliminated pure components of a similar biochemical makeup from model consideration. Further, the input variables constrain the model to a specific shape for each pure component, preventing deeper analysis into minute spectral changes in line shape or other phenomena that accompany protein denaturation and microstructural changes. 140 Although not an exact depiction of ECM changes in POP, the NNLS model represents a complementary approach to peak deconvolution and a critical first step to understanding the biochemical changes in the vagina related to prolapse. Further, the histology presented herein has provided orthogonal support of some NNLS modeling results; however, future work validating additional model components such as lipid content will require cryopreservation protocols. Additional research investigating alternate spectral modeling methods that can include and differentiate relevant ECM constituents is necessary to improve interpretability and assist in treatment research.

The presented study represents a critical first step toward noninvasive optical characterization of POP in the Fbln5?/? mouse model. Further, this work exhibits significant translational potential for longitudinal monitoring in animal models of POP; however, more research is needed to determine measurement outcomes with respect to the intact murine anatomy and the current RS probe design. In addition, investigations into spatial variability in the murine vagina may provide critical insight into POP pathophysiology. The proposed technology could serve as a clinical early diagnosis tool, correlating optical biomarkers of composition to the disease's composition–function relationship before symptom manifestation.

In summary, this study quantified biochemical, histological, and biomechanical changes in a knockout murine model of POP and compared them to aged-matched wildtype littermates. These nondestructive and label-free measurements of tissue ECM composition correlated with histological properties in a mouse model of POP. Further, we have presented an established and verified workflow for nondestructive compositional analysis with future implications in noninvasive clinical POP evaluation and treatment monitoring. A future direction will serve to extend this research to human subjects for technological validation to establish this approach as a viable clinical tool for patient tissue assessment.