自发荧光寿命成像解析外周血单核细胞内的细胞异质性

《Biophotonics Discovery》：Autofluorescence lifetime imaging resolves cell heterogeneity within peripheral blood mononuclear cells

　　

PBMC染色与图像处理工作流程。(a) 通过外周全血的密度梯度离心分离PBMC，并将其接种于96孔板的孔中。(b) 每个孔中加入一种荧光抗体，以识别混合培养中的单细胞类型。所使用的荧光报告基团包括PerCP、PerCP-Cy5.5、StarBright Blue 700（SBB700）和Brilliant Blue 700（BB700）。(c) 从染色强度和NAD(P)H强度图像中生成单细胞掩膜，以提取指定细胞的OMI特征。

发现声明

我们证明，自发荧光寿命成像可以解析人体血液免疫细胞混合培养中的功能性及表型代谢亚群。这提供了一种新的技术，用于表征患者外周血免疫细胞内的代谢活性，可能改善疾病诊断和细胞治疗产品的生产。

1. 引言

外周血单个核细胞（PBMCs）是一类多样化的免疫细胞群体，包括淋巴细胞（T细胞、B细胞和NK细胞）和髓系细胞（单核细胞）。1由于免疫学异质性高，PBMCs被广泛应用于免疫系统建模和疾病进展监测。2,3此外，PBMCs常作为细胞治疗的起始材料。4,5 PBMCs还提供了一种易于获取的免疫细胞群体，可通过简单的密度梯度离心从全血中快速分离。PBMC样本通常使用流式细胞术进行评估，通过前向散射和侧向散射提供PBMC样本中淋巴细胞和单核细胞的比例。1,6 对荧光标记的表面标志物进行流式细胞术分析可进一步识别T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞群体，并提供功能性测量，如激活状态。然而，荧光标记可能干扰生物学过程，且需要耗时的染色程序，可能改变细胞特征。7–10此外，标准流式细胞术通常不评估细胞代谢，而代谢状态可以揭示与表面标志物相比具有独特性的细胞亚群和细胞功能状态。11–14

静息状态的PBMCs不仅包含功能多样的细胞亚集，还包含代谢上存在差异的细胞亚集。静息T细胞通过脂肪酸氧化（FAO）的氧化磷酸化（OXPHOS）产生大部分三磷酸腺苷（ATP）。15–17 用寡霉素处理的静息淋巴细胞（主要为T细胞）无法增加糖酵解，这进一步支持T细胞几乎完全依赖FAO/OXPHOS进行能量产生，代谢灵活性很低。18 与静息T细胞类似，静息B细胞摄取葡萄糖很少，维持少量且小的线粒体，并表现出极低代谢率，使静息T细胞和B细胞在代谢上都很"安静"。19,20 作为固有免疫细胞，单核细胞已为快速激活做好准备，因此与静息淋巴细胞相比，在静息状态下保持较高的代谢率。18 尽管静息单核细胞主要依赖FAO/OXPHOS产生大部分ATP，但糖酵解和谷氨酰胺解仍然作为重要的次要能量来源，使单核细胞能够在激活时快速切换为糖酵解。18 NK细胞传统上被描述为类似单核细胞的固有免疫细胞，但它们与B细胞和T细胞来源于相同的淋巴细胞谱系。21 因此，NK细胞维持中等水平的代谢活性，其OXPHOS依赖程度高于单核细胞但低于T细胞和B细胞，同时还将葡萄糖作为重要的次要能量来源。22–24 激活后，NK细胞表现出糖酵解和OXPHOS速率均增加，并大量产生乳酸。22–24 激活后，细胞代谢呈现异质性，糖酵解对于多种免疫细胞（包括CD8+ T细胞、单核细胞和NK细胞）的炎症功能至关重要，24–26 而OXPHOS对于B细胞激活、免疫抑制功能（如调节性T细胞）和记忆形成至关重要。19,27,28

免疫细胞代谢正成为免疫细胞行为和疾病状态的关键特征，因为与表现出延迟表达的表面标志物相比，代谢更能与免疫细胞功能的时序变化相一致。29,30 PBMC代谢状态已被证明在预测心力衰竭严重程度、31 认知衰退、32,33 癌症治疗反应、34,35 以及炎症性疾病严重程度（如脓毒症和系统性红斑狼疮（SLE））36–38 方面取得成功。PBMC代谢还与体能水平和身体虚弱程度相关，揭示PBMCs作为全身代谢健康的重要标志物。39–42 代谢还识别了仅凭表面标志物表达无法定义的免疫细胞亚群中的异质性，例如，通过识别更成功的嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗的代谢标志物13，以及识别谷氨酰胺依赖性T细胞和B细胞在SLE中驱动炎症的作用，提供了有前景的治疗靶点。43,44 因此，能够测量PBMCs内单细胞代谢的工具可以提供有关免疫细胞功能和异质性的宝贵信息，超越传统的表面标志物表达。

代谢辅因子——烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）还原形式（NAD(P)H）和黄素腺嘌呤二核苷酸氧化形式（FAD）的荧光强度和寿命成像，即光学代谢成像（OMI），可提供单个细胞的单细胞代谢成像。45–47 NAD(P)H存在于游离态和蛋白结合态，分别表现出短寿命和长寿命。48,49 相反，FAD的游离态和蛋白结合态分别具有长寿命和短寿命。50 这些寿命对分子微环境（如pH、粘度、温度、离子强度）敏感，51–53 蛋白结合寿命也因结合伙伴不同而变化。54–56 此外，NAD(P)H和FAD的荧光强度用于计算光学氧化还原比（ORR）。57–59 虽然ORR有多种定义，但在此，ORR定义为NAD(P)H强度/[NAD(P)H+FAD]强度。OMI依赖于内源性对比来源，这种无标签成像技术具有吸引力，因为不需要样品操作。因此，可以在完整的培养体系中在终点分析之前对同一批细胞进行重复成像，或者可以在细胞用于细胞制造或细胞治疗之前对其进行成像。

OMI已成功对原代人中性粒细胞、60 T细胞、61–63 B细胞64和NK细胞64单培养中的静息和激活进行分类，并在成批CD3+ T细胞培养中区分了CD4+和CD8+ T细胞。63 自发荧光信号也揭示了外周血中几种免疫细胞群体之间的差异，包括淋巴细胞、单核细胞和几种粒细胞。65,66 尽管以前的研究仅在单培养或静息系统中探索了免疫细胞的自发荧光特征，但本文首次表明OMI可以分类原代人供者PBMCs中的激活状态和免疫细胞亚群。这可以提供一种新工具来测量PBMCs内的单细胞代谢，从而提供无标签的代谢信息，以更好地监测以免疫激活为特征的疾病（如脓毒症、SLE、类风湿关节炎），并筛选用于细胞治疗的PBMCs（如验证起始细胞和产品的代谢适宜性）。

2. 方法

2.1. 细胞制备

在威斯康星大学麦迪逊分校机构审查委员会批准的条件下，从健康成年供者的外周血中分离PBMCs。所有供者均根据《赫尔辛基宣言》签署了书面知情同意书。在获得供者书面知情同意书后，使用无菌注射器将10 mL全血抽取至涂有肝素钠（158美国药典单位）的真空采血管中。将全血与等体积的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）+ 2%胎牛血清（FBS）混合，并层叠在50 mL SepMate管（Stemcell Technologies）中15 mL Lymphoprep密度梯度液（Stemcell Technologies，加拿大温哥华）之上。将试管以1200×g离心10分钟，不刹车。吸取黄色血浆层，将浑浊的PBMC层转移到新管中，用DPBS + 2% FBS洗涤，以800×g离心5分钟，刹车开启。将PBMC沉淀重悬于培养基（RPMI1640 + 2 mM谷氨酰胺 + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素）中，浓度为2×106 PBMCs/mL。

将PBMCs以每孔5×105个PBMCs/200 μL培养基的密度接种于多聚-L-赖氨酸包被的玻璃96孔板的孔中，不加激活剂（静息状态）或加入40 nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和1 μM离子霉素（激活状态）。接种后，每个含有混合PBMCs的孔中加入1.0 μL一种荧光抗体（每个孔一种）孵育30分钟（PerCP-Cyanine5.5-αCD4、PerCP-Cyanine5.5-αCD8、PerCP-αCD14、StarBright Blue 700-αCD19、Brilliant Blue 700-αCD56）[图1(a)–1(b)] [补充材料中的表S1]，以识别混合培养中的单一细胞群体[图1(c)]。通过以800×g离心细胞30秒并弃去上清液来去除过量的荧光抗体。细胞用DPBS + 2% FBS洗涤3次，最后重悬于200 μL培养基中。初始接种后2小时，使用OMI对静息和激活的PBMCs进行成像。

图1下载全尺寸图像

PBMC染色与图像处理工作流程。(a) 通过外周全血的密度梯度离心分离PBMC，并将其接种于96孔板的孔中。(b) 每个孔中加入一种荧光抗体，以识别混合培养中的单细胞类型。所使用的荧光报告基团包括PerCP、PerCP-Cy5.5、StarBright Blue 700（SBB700）和Brilliant Blue 700（BB700）。(c) 从染色强度和NAD(P)H强度图像中生成单细胞掩膜，以提取指定细胞的OMI特征。

2.2. 光学代谢成像

在成像期间，将PBMCs置于台上培养箱（Tokai Hit，日本富士见市）中，温度为37°C，CO2浓度为5%。使用自制的双光子显微镜（Bruker，美国马萨诸塞州比勒里卡）对细胞进行成像，采用Prairie View软件（Bruker）和40×（NA=1.15）水浸物镜（Plan Apo，Nikon，日本西尾市），数字扫描放大倍数为1.5×。使用80 MHz脉冲重复频率的InSight DS+可调谐飞秒脉冲激光器（Spectra-Physics Inc.，美国加利福尼亚州米尔皮塔斯市），将波长调至750 nm以激发NAD(P)H和荧光标记的抗体，样品处平均功率为6.0 mW；使用890 nm激发FAD，样品处平均功率为15.0 mW。在每次实验内，激光功率保持恒定。使用H7422PA-40 GaAsP光电倍增管（Hamamatsu，日本滨松市）检测荧光发射，并使用466/40 nm带通滤镜分离NAD(P)H荧光、520/40 nm带通滤镜分离FAD荧光，以及590 nm长通滤镜收集标记抗体的荧光。使用Time Tagger Ultra（Swabian Instruments GmbH，德国斯图加特）捕获荧光衰减。光子计数率保持在1.5×105 光子/秒，以确保可靠的寿命拟合。

使用4.8 μs的像元停留时间和60 s的积分时间，同时收集NAD(P)H和荧光标记抗体的512×512像素（200 μm×200 μm）荧光寿命图像，然后收集FAD图像。每日从尿素晶体的二次谐波产生中收集仪器响应函数（IRF）。根据细胞类型的丰度，每种细胞类型收集3至10个视野的图像。

2.3. 图像分析

使用SPCImage（v8.9，Becker & Hickl，德国柏林）提取像素级的光子到达时间直方图。为提高荧光寿命测量的准确性，对NAD(P)H图像使用二值因子（在5×5像素核中合并25个像素），对FAD图像使用三值因子（在7×7像素核中合并49个像素）进行分箱，使每个衰减中至少有2500个光子。通过阈值处理去除低强度背景像素。NAD(P)H和FAD以游离态和蛋白结合态存在，具有不同的短寿命和长寿命组分。49,50 使用迭代IRF重卷积和参数优化，在Poisson统计/分布下最大化观测数据似然（最大似然估计算法），将逐像素的NAD(P)H和FAD衰减曲线拟合为双指数模型[公式(1)]。

公式(1) ??(??)=?????^(???/???)+?????^(???/???)+??

其中??(??)是激光脉冲后时间??处的自发荧光强度。短（猝灭）寿命和长（未猝灭）寿命组分分别表示为???和???，各组的振幅分别表示为???和???。??表示非衰减背景光的振幅。此外，在每个像素处计算NAD(P)H和FAD的平均寿命[公式(2)]。

公式(2) ???=(??????+??????)/(???+???)

使用cellpose67中的cyto2模型从抗体荧光强度图像生成全细胞掩膜，参数为直径=50像素（~20 μm），细胞概率阈值=-0.50，流量阈值=-25。将掩膜叠加到NAD(P)H强度图像上，并使用Napari68手动校正以去除掩膜中的碎片和运动伪影，确保掩膜仅覆盖单个细胞。使用Python中的cell-analysis-tools69在每个单细胞掩膜上对荧光寿命变量取平均值。在结果中，???和???指归一化分数???/(???+???)和???/(???+???)，以百分比值表示。

光氧化还原比（ORR）通过公式（3）在细胞水平上计算，该公式对所有细胞像素的NAD(P)H和FAD荧光求和，并将ORR约束在0到1之间。公式（3）：ORR=I_NAD(P)H/(I_NAD(P)H+I_FAD)。光子计数较低的细胞（NAD(P)H平均细胞强度总和<10 a.u.）、掩膜过小而不可能是细胞的（<70像素），以及拟合度较差（χ2>1.3）或NAD(P)H τ?<350 ps的细胞均被排除在分析之外。单变量图使用matplotlib??和seaborn?1生成。

2.4. 24小时激活与代谢物分析

培养24小时后，收集未染色的激活或静息PBMC孔的培养基，并于?20°C冷冻保存。将细胞重悬于200 μL新鲜培养基中，加入0.10 μL 10 mg/mL Hoechst 33342（ThermoFisher，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国）和1 μL PerCP-αCD69抗体（见补充材料中的表S1）。30分钟后，按照上述方法洗去多余抗体，将细胞重悬于200 μL培养基中。使用Nikon Ti-2E配合380至660 nm SOLA光源引擎（Lumencor，俄勒冈州比弗顿，美国）采集强度图像。光线通过40×（NA=0.95）空气物镜（Plan Apo，Nikon，日本东京）收集，并由Hamamatsu Orca-Flash数字CMOS相机检测。Hoechst在340至380 nm范围内以26%功率（0.56 W/cm2）激发1 ms，发射光在435至485 nm范围内检测。PerCP-αCD69在550至590 nm范围内以26%功率（3.3 W/cm2）激发20 ms，发射光在608至683 nm范围内检测。

使用Cellpose中的cyto2模型从明场图像中识别单个细胞，参数设置为直径=100，细胞概率阈值=?0.50，流阈值=?25。将掩膜应用于PerCP-αCD69图像，收集每个细胞的平均PerCP强度，并构建直方图（使用seaborn/matplotlib）显示CD69?和CD69?群体。CD69?阈值设定为静息群体平均值以上1.5个标准差。

进行了乳酸检测以验证激活后有氧糖酵解的上调?2。乳酸比色检测按照检测试剂盒（BioVision，加利福尼亚州米尔皮塔斯，美国）进行。简要步骤为：将每种培养基样品2 μL加入198 μL检测缓冲液中，并将50 μL溶液加入96孔板的三个复孔中。向每个孔中加入50 μL反应混合物（2 μL探针，2 μL酶混合物和46 μL检测缓冲液），在37°C下孵育30分钟。使用微孔板读数仪在570 nm处测量光密度。使用普通最小二乘回归模型对乳酸标准品浓度系列的拟合结果进行拟合，R2为0.9975。

2.5. 分类器与统计

使用scikit-learn?3在Python中训练随机森林分类器，对随机选择的70%细胞进行训练，在剩余30%细胞上进行测试，使用10个OMI变量（NAD(P)H和FAD的τ_m、τ?、τ?、α?，ORR及细胞面积）。通过受试者工作特征（ROC）曲线、ROC曲线下面积、准确率、精确率和召回率评估分类器的强度。在不同随机细胞集上训练和测试分类器，以检验这些指标的一致性。为防止模型偏向多数类并确保任何类别的误分类受到同等惩罚，在训练之前通过随机欠采样将所有类别的频率匹配到少数类，实现类别平衡。

使用统一流形近似与投影（UMAP）??图可视化单细胞异质性，该图使用Python和Scikit-learn生成，基于10个OMI变量（NAD(P)H和FAD的τ_m、τ?、τ?、α?，ORR及细胞面积）。UMAP使用欧氏距离计算，最近邻参数设置为6，最小距离设置为0.6。异质性分析通过计算每种激活或静息细胞类型中每个变量的均值和标准差来完成。变异系数计算为标准差与均值的比值，提供跨不同变量的单细胞异质性的归一化度量。Z分数热图使用Python和seaborn的clustermap函数构建。单细胞基于OMI变量使用Ward链接法和欧氏距离进行层次聚类。激活条件、供体和细胞类型作为行注释添加，但未纳入聚类分析。

除另有说明外，单变量的统计分析使用Cohen's d??（效应量的度量）进行，原因是单细胞数据点数量较大??[公式（4）]。公式（4）：d=(M??M?)/√((SD?2+SD?2)/2)，其中M和SD分别代表各组的均值和标准差。|d|<0.2表示无变化，0.2≤|d|<0.5表示小变化，0.5≤|d|<0.8表示中等变化，|d|≥0.8表示大变化??。为减少抽样误差，每种条件下每种细胞类型至少评估100个细胞。除非另有说明，所有标注Cohen's d的比较均通过Kruskal-Wallis检验达到p<0.05。

3. 结果

3.1. OMI对静息PBMC亚型的分类

静息PBMC使用荧光标记抗体染色，使得能够在异质性PBMC培养中识别以下细胞类型：辅助T细胞（CD4?）、细胞毒性T细胞（CD8?）、单核细胞（CD14?）、B细胞（CD19?）和NK细胞（CD56?）。值得注意的是，与其他细胞类型相比，静息状态下的单核细胞表现出较低的NAD(P)H τ_m、较高的NAD(P)H α?和较大的细胞面积[图2(a)–2(d)]。静息B细胞与T细胞和NK细胞相比，也表现出略高的NAD(P)H α?[图2(c)]。静息PBMC的其他所有OMI变量按亚型绘制于补充材料中的图S1。

图2 下载全尺寸图像：静息单核细胞和淋巴细胞具有不同的自发荧光。(a)静息PBMC细胞群的代表性图像。(b)–(d)静息PBMC细胞群的NAD(P)H τ_m、NAD(P)H α?和细胞面积。数据以箱线图显示，代表中位数和四分位距（IQR），须线在1.5×IQR处。图中叠加了按供体A、B或C着色的单个细胞。效应量以Cohen's d的绝对值表示。不显著和小效应量（|d|<0.5）未显示；中等（0.5≤|d|<0.8）和大效应量（|d|≥0.8）已显示。所有标注Cohen's d的比较均通过Kruskal-Wallis检验达到p<0.05。(e)–(f)一对其余随机森林分类器使用所有OMI变量（NAD(P)H和FAD的τ_m、τ?、τ?和α?，ORR及细胞面积）在70%数据上训练并在剩余30%上测试。(e)每种细胞类型分类的ROC曲线和(f)混淆矩阵，显示细胞数量和各行细胞百分比。ROC中虚线参考线表示随机猜测（AUC=0.50）。n=553个辅助T细胞，554个细胞毒性T细胞，425个单核细胞，368个B细胞，510个NK细胞。

使用10个OMI变量的一对其余随机森林分类器在70%的静息PBMC上训练并在剩余30%上测试。单核细胞被有效分类（AUC=0.98，召回率=96.4%）[图2(e)–2(f)]。最有效区分单核细胞和淋巴细胞的变量是NAD(P)H τ_m（特征重要性=57.3%）和NAD(P)H α?（特征重要性=18.0%）[补充材料中的图S2]。细胞毒性T细胞、辅助T细胞和B细胞基于OMI变量未被强力分辨[图2(e)–2(f)]。然而，NK细胞的分类中等准确（AUC=0.91，召回率=73.6%）[图2(e)–2(f)]，分类最重要的变量为ORR（特征重要性=20.5%）、FAD τ?（特征重要性=18.6%）和FAD α?（特征重要性=16.3%）[补充材料中的图S2]。

3.2. OMI对PBMC亚型早期激活的分类

为捕捉激活带来的变化，将PBMC接种并培养于强效免疫细胞激活剂（40 nM PMA和1 μM电离霉素）中2小时后进行成像。代表性图像展示了早期激活的定性变化，包括单核细胞中观察到的更大的细胞内异质性和颗粒性[图3(a)]。与静息条件一样，激活的单核细胞相比其他激活的PBMC具有较低的NAD(P)H τ_m、较高的NAD(P)H α?和较大的细胞面积[图3(b)–3(d)]。然而，与静息状态相比[图2(b)–2(d)]，激活时单核细胞与其他PBMC细胞类型之间的效应量较小[图3(b)–3(d)]，表明激活时代谢同质性增加。激活PBMC的其他所有OMI变量按亚型绘制于补充材料中的图S3。

图3 下载全尺寸图像：激活的单核细胞和淋巴细胞具有不同的自发荧光。(a)PBMC中激活的（2小时PMA/电离霉素）细胞群的代表性图像。(b)–(d)激活PBMC细胞群的NAD(P)H τ_m、NAD(P)H α?和细胞面积。数据以箱线图显示，代表中位数和四分位距（IQR），须线在1.5×IQR处。图中叠加了按供体A、B或C着色的单个细胞。效应量以Cohen's d的绝对值表示。不显著和小效应量（|d|<0.5）未显示；中等（0.5≤|d|<0.8）和大效应量（|d|≥0.8）已显示。所有标注Cohen's d的比较均通过Kruskal-Wallis检验达到p<0.05。(e)–(f)一对其余随机森林分类器使用所有OMI变量（NAD(P)H和FAD的τ_m、τ?、τ?和α?，ORR及细胞面积）在70%数据上训练并在剩余30%上测试。(e)每种细胞类型分类的ROC曲线和(f)混淆矩阵，显示细胞数量和各行细胞百分比。ROC中虚线参考线表示随机猜测（AUC=0.50）。n=363个辅助T细胞，353个细胞毒性T细胞，305个单核细胞，340个B细胞和267个NK细胞。

使用10个OMI变量的一对其余随机森林分类器在70%的激活PBMC上训练并在剩余30%上测试。在激活的PBMC中，单核细胞仍与淋巴细胞区分明显（AUC=0.94，召回率=87.5%）[图3(e)–3(f)]，但预测能力略弱于静息PBMC（AUC=0.98，召回率=96.4%）[图2(e)–2(f)]。在激活的PBMC中，单核细胞分类主要依赖于细胞面积（特征重要性=31.0%），其次是NAD(P)H α?（特征重要性=15.6%）[补充材料中的图S4]。在这个早期激活时间点，细胞毒性T细胞、辅助T细胞和B细胞未能清晰识别。激活的NK细胞仍保持中等分类准确率（AUC=0.91，召回率=73.8%）[图3(e)–3(f)]，最高变量权重来自FAD τ?（特征重要性=21.1%）和NAD(P)H τ_m（特征重要性=16.1%）[补充材料中的图S4]。

培养24小时后确认了激活，与静息PBMC相比（<1% CD69?），乳酸产量增加70%且CD69表达增加（79.6% CD69?）[补充材料中的图S5]，与现有文献一致?3,??。

3.3. OMI评估PBMC中的单细胞代谢异质性

细胞类型依赖的激活动态在图4(a)中总结，该图显示了静息和激活条件下每个变量和细胞类型的效应量（细胞计数见补充材料中的表S2）。所有淋巴细胞（T细胞、B细胞、NK细胞）在激活后2小时的NAD(P)H τ_m均下降且NAD(P)H α?均升高，与静息状态相比，这与免疫激活的先前发现一致13,?3,??[图4(a)]。相反，单核细胞在激活后2小时相比静息条件的NAD(P)H τ_m增加且NAD(P)H α?下降[图4(a)]。静息和激活条件下的代表性未掩膜NAD(P)H和FAD τ_m图像展示了图像水平的细胞异质性[补充材料中的图S6]。所有PBMC亚型在激活时一般ORR均增加，表明向还原型细胞内环境转变，且NAD(P)H τ?均下降[图4(a)]。

图4 下载全尺寸图像：代谢异质性随激活增加。(a)按供体和变量着色的激活与静息细胞类型的效应量，按低（0.2≤|d|<0.5）、中等（0.5≤|d|<0.8）、大（|d|≥0.8）和不显著（|d|<0.2）效应量以及激活变化的方向性（增加为红色，减少为蓝色）着色。(b)UMAP显示按激活条件聚类。(c)–(d)激活与静息PBMC的随机森林分类器ROC曲线（带标注操作点）和混淆矩阵，显示细胞数量和各行细胞百分比（准确率=93.6%）。ROC中虚线参考线表示随机猜测（AUC=0.50）。(e)随机森林分类器中10个OMI变量的相对重要性。(f)变异系数（COV = 标准差/均值）显示每种静息和激活细胞群内的代谢变异性。(g)UMAP显示按激活条件和细胞类型聚类。n=2410个静息PBMC和1628个激活PBMC。按供体、细胞类型和激活条件的细胞计数见补充材料中的表S2。

使用10个OMI变量的统一流形近似与投影（UMAP）可以观察到激活和静息PBMC的独立聚类[图4(b)]。静息和激活的PBMC总体可以高准确率分类（AUC=0.98，准确率=93.6%）[图4(c)–4(d)]。该分类器中权重最高的变量包括ORR（特征重要性=23.6%）和NAD(P)H τ?（特征重要性=15.5%）[图4(e)]。

这些变量在所有PBMC亚型中与活化状态之间显示出最为一致的转变[图4(a)]。使用变异系数评估了各细胞类型内OMI变量的变化[图4(f)]。尽管如NAD(P)H ??1、FAD ??1和ORR等变量在静息和活化条件下均表现出较低的变异水平，但大多数细胞类型和变量在活化后异质性增加。FAD ??1、FAD ??m和细胞面积在活化时表现出最大的异质性，尽管这些变量在静息状态下已显示出相对较高水平的异质性[图4(f)]。当以细胞和活化状态着色时，UMAP显示静息和活化的单核细胞（紫色）及NK细胞（蓝色）的独立聚类[图4(g)]。辅助性T细胞（绿色）、细胞毒性T细胞（红色）和B细胞（橙色）在定性上聚为同一类，尽管这些细胞的活化聚类与静息聚类有所不同[图4(g)]。值得注意的是，单核细胞占据了一个独立聚类，该聚类更紧密地与活化的PBMCs相关联，使用相同的10个OMI变量进行层次聚类分析进一步证实了这一点[补充材料中的图S7]。由于尺寸限制，热图沿前两个层次聚类进行了分割。聚类1由低NAD(P)H ??1定义，主要包含静息淋巴细胞，而聚类2显示高NAD(P)H ??1，包含活化的PBMCs和静息单核细胞。

NK细胞通常使用CD56进行鉴定，CD56以高表达（bright）和低表达（dim）水平存在，其中CD56 bright NK细胞约占血液NK细胞群体的～10%，产生更多的细胞因子，细胞毒性较低，且相比CD56 dim群体更依赖糖酵解。22,77 因此，我们探讨了OMI能否识别CD56 dim与bright NK细胞之间的代谢差异。我们使用100 a.u.的阈值定义CD56 bright NK细胞，捕获了约前10%最亮的αCD56 NK细胞[补充材料中的图S8(a)–S8(b)]。与dim细胞相比，CD56 bright细胞中NAD(P)H ??m、??1和??2显著降低[补充材料中的图S8(c)–S8(f)]，这与CD56 bright群体中糖酵解增加一致，并在所有OMI变量的UMAP上呈现一定程度的聚类[补充材料中的图S8(g)]。

4. 讨论

PBMCs常规用于疾病诊断和细胞治疗开发，但传统工具不考虑代谢异质性，而代谢异质性提供了关键的 functional 信息。例如，OMI此前鉴定了CAR T细胞中仅靠表面标志物表达无法发现的代谢亚群，从而在体内改善了肿瘤治愈率。13 同样，患者PBMCs的代谢通量分析鉴定了脓毒症的早期标志物，可指导及时的治疗决策以改善患者生存率。37 在此，我们展示了一种无标记、非破坏性的成像技术，用于分析静息和活化原代人PBMCs中的单细胞代谢表型。我们的分析揭示，OMI可以以较高的分类准确度识别静息和活化PBMCs中的单核细胞（AUC>0.94）以及NK细胞（AUC=0.91）。此外，OMI可以准确分类PBMCs中的早期活化状态（刺激后2小时，AUC=0.98）。尽管CD69和CD25是公认的免疫活化标志物，但在此我们展示了一种无标记方法，由于标记步骤无需人工操作，因此可在临床工作流程中实现快速自动化分析。

与静息PBMCs相比，大多数细胞亚型在活化PBMCs中的分类准确度有所下降[图2(e)–2(f)和3(e)–3(f)]。这可能是由于PMA/异丁基咪唑酮诱导的活化在各PBMCs中产生相似的早期代谢变化，PMA通过蛋白激酶C活化无差别地上调所有PBMCs的代谢需求。然而，更具生理相关性的免疫激活剂（如抗体、白介素和其他分泌因子）可能在PBMCs亚群中产生不同的代谢和时间响应，可能需要训练新的分类器。

我们的PBMC活化发现与先前研究一致，先前研究发现在不同时间点使用不同活化方法在T、B和NK细胞单培养中观察到NAD(P)H ??1和ORR在活化后增加。13,62–64 尽管活化传统上通过表面标志物表达来确认，特别是使用抗CD69或抗CD25抗体，但这些标志物并不完美，可能需要数小时才能完全表达，而分泌因子和代谢物可能需要数小时才能在培养基中积累到可检测水平，随后还需要额外的处理时间。这凸显了OMI对早期活化（刺激后2小时）的迅速性和敏感性。此外，先前的研究报告表明，天然髓系细胞（如单核细胞）的糖酵解需求高于淋巴细胞，18 这支持了我们UMAP[图4(g)]和层次聚类[补充材料中的图S7]中单核细胞与活化淋巴细胞的聚类结果。

活化后NAD(P)H ??1的普遍降低表明每种细胞亚型的生化环境发生改变，促进了游离NAD(P)H的猝灭，从而缩短了荧光寿命。异丁基咪唑酮是一种强效钙离子载体，因此增加细胞内钙浓度，可能促进NAD(P)H猝灭。尽管我们观察到的NAD(P)H ??1降低幅度较大，但先前研究报告表明，使用更具生理相关性的免疫激活剂（包括针对CD2/CD3/CD28的四聚体抗体活化T细胞和IL-12/IL-15/IL-18刺激NK细胞）也能观察到NAD(P)H ??1降低，表明这种效应并非仅由异丁基咪唑酮诱导。13,63,64

在此，CD4+和CD8+ T细胞之间未观察到显著差异，而先前研究已表明CD4+和CD8+ T细胞在CD3+ T细胞系统中OMI参数存在分离。63 这一差异可能是由于PBMC样品中存在多种细胞亚型，其中分泌因子和细胞-细胞相互作用影响细胞代谢，与T细胞单培养不同。此外，这些先前研究发现，在混合CD3+培养中CD4+和CD8+ T细胞代谢与单独培养CD4+或CD8+细胞时有所不同。63 此外，这些先前研究使用了针对CD2/CD3/CD28的四聚体抗体，该抗体诱导T细胞产生更具生理相关性的活化反应。已知该反应在CD4+和CD8+ T细胞之间存在差异，而PMA/异丁基咪唑酮在两种T细胞中产生更为相似的反应。63,78 这凸显了激活剂和微环境在调节免疫细胞代谢中的关键作用。

我们发现，无论是静息还是活化状态，OMI本身都无法可靠地分辨PBMCs中的所有免疫细胞亚型。加入形态学和纹理等特征可提高对PBMC亚群的敏感性。此外，OMI可与其他无标记成像技术结合以提高敏感性。最后，可以对免疫细胞亚群进行荧光标记并结合OMI分析，以提高对特定细胞群体的敏感性。总之，本研究证明OMI能够成功表征复杂PBMC培养物中的一些细胞异质性，识别PBMCs中的单核细胞和NK细胞，并准确分类PBMCs中的早期活化状态。

细胞代谢提供了免疫细胞功能的快速敏感测量，这难以仅通过表面标志物表达来获取。因此，PBMCs内的单细胞代谢测量可增强当前的诊断测试（如脓毒症和SLE）及细胞治疗的质量筛选（如CAR T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞治疗）。尽管传统代谢测量需要标记或破坏样品，但OMI提供了无标记、非破坏性的单细胞代谢特征测量，能够区分PBMCs的代谢亚群。因此，OMI可与传统破坏性方法（如单细胞RNA测序和抗体标记流式细胞术）多重联合使用，或OMI可独立用于在细胞治疗下游应用前表征细胞。NAD(P)H寿命测量还可在流动构型中进行，79 这将简化免疫表型分析在临床和生物制造环境中的转化应用，包括疾病监测、药物筛选和细胞治疗开发。

5. 结论

PBMCs在临床上用于监测疾病状态并作为细胞治疗的起始材料。细胞代谢是PBMC功能和质量的一个敏感特征，但目前尚无非破坏性技术可测量PBMCs内的单细胞代谢。在此，我们发现OMI提供了无标记的单细胞代谢测量，能够识别PBMCs中的免疫细胞亚群（单核细胞、NK细胞）和早期活化状态（刺激后2小时），无需染色即可实现高通量代谢筛选。因此，OMI可提供额外的代谢信息以补充传统的PBMC测量，从而改善疾病监测、免疫疗法开发以及其他受益于无接触代谢表型分析的应用。