《Frontiers in Immunology》：Astilbin: a novel therapeutic strategy for bone destruction in rheumatoid arthritis
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背景：骨破坏是类风湿关节炎（RA）患者残疾的主要原因。草药具有独特的多靶点优势，使其成为缓解RA相关骨损伤的有前景的治疗候选药物。
目的：本研究旨在探讨落新妇苷（一种从土茯苓（Smilax glabra）中提取的核心生物活性黄酮类化合物）对RA骨破坏的治疗
背景：骨破坏是类风湿关节炎（RA）患者残疾的主要原因。草药具有独特的多靶点优势，使其成为缓解RA相关骨损伤的有前景的治疗候选药物。
目的：本研究旨在探讨落新妇苷（一种从土茯苓（Smilax glabra）中提取的核心生物活性黄酮类化合物）对RA骨破坏的治疗效果及其潜在机制。
方法：通过尾静脉注射II型胶原蛋白建立胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型。采用显微计算机断层扫描（Micro-CT）、苏木精-伊红（HE）染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色评估落新妇苷对RA骨破坏的抑制和治疗效果。通过网络药理学和生物信息学分析筛选落新妇苷治疗RA的潜在靶点和信号通路。进一步进行孟德尔随机化分析，在遗传学上验证候选基因与RA之间的相关性。利用分子对接计算落新妇苷与RA核心致病靶点之间的结合能。采用免疫荧光、酶联免疫吸附测定（elisa）、蛋白质印迹（WB）和实时荧光定量PCR（qPCR）验证落新妇苷改善RA骨侵蚀的关键靶点及抗炎活性。
结果：体内动物实验表明，落新妇苷可减轻RA骨破坏、抑制滑膜增生、抑制破骨细胞生成，并下调促炎细胞因子的表达。网络药理学鉴定出MAPK3、MAPK1、PTPN11、HSP90AA1、STAT1和SRC是落新妇苷抗RA的核心治疗靶点。KEGG富集分析显示，落新妇苷的抗RA作用与MAPK信号通路等密切相关。孟德尔随机化分析进一步验证了凋亡蛋白MAPK3与RA之间存在强烈的遗传相关性。分子对接结果显示落新妇苷与RA关键致病靶点之间具有良好的结合亲和力。
结论：落新妇苷可能通过调控MAPK信号通路发挥多种药理作用，包括抗炎、抑制破骨细胞活化、改善骨微结构和减轻RA骨破坏，并在体内表现出良好的安全性。
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以慢性系统性自身免疫紊乱为特征的致残性炎性关节病，其病理进展包括滑膜慢性炎症浸润和异常血管翳增生两个核心环节，而不可逆的骨与软骨破坏是决定关节畸形、肢体功能丧失及长期生活质量受损的终末病理改变。当前临床治疗方案如非甾体抗炎药（NSAIDs）、传统合成改善病情抗风湿药（csDMARDs）及生物制剂虽能部分抑制全身炎症、缓解关节肿痛，但存在无法特异性阻断破骨细胞过度活化、难以逆转已形成的骨侵蚀、长期使用易致胃肠损伤、肝肾功能障碍及骨髓抑制等毒副作用，且连续用药易产生耐药性并伴随炎症反跳和骨破坏进展。因此，开发兼具抗炎与骨保护双重作用、低毒低耐药的新型活性分子成为风湿免疫领域的研究热点。中药具有多靶点及良好安全性等独特优势，落新妇苷是土茯苓（Smilax glabra Roxb.）中分离的主要生物活性黄酮单体，已有研究证实其可抑制促炎细胞因子表达并与甲氨蝶呤（MTX）联合改善RA，但对其调控RA特征性骨破坏的关键靶基因和分子通路尚缺乏系统阐释，且现有研究多局限于单一动物模型，缺少从遗传因果、网络预测、分子互作到体内药效的完整多维证据链。本研究即在此背景下，整合网络药理学、孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）、分子对接及胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）小鼠模型，系统探究落新妇苷抗RA骨破坏的分子机制，旨在提供新型治疗策略，相关成果发表于《Frontiers in Immunology》。
研究人员首先利用多个公共数据库预测落新妇苷与RA的潜在共享靶点：从Comparative Toxicogenomics Database、PharmMapper、SwissTargetPrediction及TCMSP数据库获得329个药物靶点，从Therapeutic Target Database、PharmGKB及OMIM数据库获得4238个RA疾病基因，取交集后得到200个候选治疗靶点；随后通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并利用Cytoscape cytoNCA插件筛选出6个核心靶点。同时采用KEGG和GO富集分析探索信号通路。孟德尔随机化分析基于FinnGen联盟的RA全基因组关联研究（GWAS）汇总数据（共331,429名欧洲受试者）、GTEx与eQTLGen联盟的expression quantitative trait locus（eQTL）数据及Fenland研究的protein quantitative trait locus（pQTL）数据，对基因表达与RA进行因果关联和共定位验证。分子对接使用Autodock Vina计算落新妇苷与核心靶点的结合能。动物实验采用36只雌性DBA小鼠，通过尾静脉注射II型胶原建立CIA模型后随机分为正常组、模型组、MTX组（1.2 mg/kg/w）及落新妇苷低（5 mg/kg/d）、中（10 mg/kg/d）、高（20 mg/kg/d）剂量组，连续灌胃4周，运用Micro-CT、HE染色、TRAP染色、WB、qPCR、免疫荧光及血清ELISA进行评估。
研究结果部分：
**3.1 网络药理学预测与PPI分析**
通过多数据库交集筛选得到200个候选靶点，PPI网络共有200个节点和719条边，平均节点度为7.19，其中48个靶点的介数中心性、接近中心性和度值高于平均水平，最终确定MAPK3、MAPK1、PTPN11、HSP90AA1、STAT1和SRC为落新妇苷治疗RA的6个核心靶点。
**3.2 KEGG和GO富集分析**
KEGG通路富集显示候选靶点显著富集于MAPK信号通路、IL-17信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路、Toll样受体信号通路和NF-κB信号通路等。GO富集分析显示生物过程主要涉及蛋白质磷酸化、细胞外基质分解、胶原分解代谢过程、血管平滑肌细胞增殖的正调控及凋亡过程；细胞组分主要涉及细胞外区域、细胞外空间和细胞外外泌体；分子功能主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性和核受体活性。
**3.3 分子对接**
分子对接结果显示落新妇苷与6个核心靶点均有强结合相互作用，其中与MAPK3的结合能最低，为?8.3 kcal/mol，表明其能稳定插入各靶蛋白的活性结合口袋，通过氢键、疏水相互作用和范德华力形成稳定复合物。
**3.4 孟德尔随机化分析阐明基因与RA的相关性**
在多种组织中均发现MAPK3表达与RA显著关联：全血GTEx数据集（P=3.81×10
?5，OR=0.789，95%CI:0.705–0.883，PPH4=0.950）及eQTLGen联盟（P=2.72×10
?3，OR=0.924，95%CI:0.878–0.973，PPH4=0.949），骨骼肌、胫神经、培养成纤维细胞和EBV转化淋巴细胞中关联具有一致性；SMR分析在蛋白水平也支持MAPK3与RA的显著关联，HEIDI检验未发现异质性证据，提示存在共享因果变异。
**3.5 落新妇苷改善全身状况并缓解RA骨破坏**
CIA模型小鼠从造模第7天起出现食量减少、活动下降、体重增长迟缓，足踝持续红肿、皮温升高。落新妇苷干预后，小鼠精神状态和活动度明显恢复，体重回升，踝关节肿胀呈剂量依赖性减轻。Micro-CT定量分析显示，模型小鼠踝关节出现严重骨侵蚀、骨小梁稀疏断裂，骨体积（BV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）显著降低，骨表面积（BS）、BS/BV比值和骨小梁分离度（Tb.Sp）升高；落新妇苷治疗显著提高BV、Tb.N、Tb.Th并降低BS、BS/BV和Tb.Sp，提示其可有效修复受损骨微结构。
**3.6 落新妇苷改善滑膜增生和炎症反应，且无明显肝肾毒性**
HE染色显示模型组踝关节滑膜明显增生、细胞排列紊乱，伴大量炎细胞浸润及局部充血水肿、纤维增生和软骨侵蚀；落新妇苷剂量依赖性地减轻滑膜增生和炎细胞浸润，恢复组织形态。TRAP染色显示模型组骨组织周围大量酒红色TRAP阳性破骨细胞聚集，落新妇苷干预显著减少破骨细胞数量。肝组织HE染色各给药组未见明显肝细胞变性、坏死或炎性浸润，血清AST、ALT、Crea、BUN水平与正常组无显著差异。ELISA结果显示模型组血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，抗炎因子IL-10降低；落新妇苷干预显著下调TNF-α、IL-1β、IL-6并上调IL-10，恢复炎症平衡。
**3.7 落新妇苷通过多靶点调控关键信号蛋白改善RA**
WB检测显示模型组关节组织中MAPK3、MAPK1、PTPN11、HSP90AA1、STAT1、SRC蛋白表达及p-MAPK1/p-MAPK3磷酸化水平均显著升高，落新妇苷各剂量均能不同程度下调这些蛋白的异常高表达并抑制过度激活。qPCR结果与WB一致，6个核心基因的mRNA水平在模型组显著上调，落新妇苷干预后呈剂量依赖性下降。免疫荧光染色进一步验证，模型组MAPK3荧光强度和阳性染色面积显著增加，落新妇苷治疗后明显减弱，表明其在翻译层面抑制MAPK3过度表达。
讨论部分指出，骨破坏是RA不可逆的关键病理事件，破骨细胞过度增殖、融合和终末分化是骨侵蚀的直接原因。滑膜慢性炎症是启动骨破坏的上游驱动力，TNF-α、IL-6、IL-17等促炎因子构成持续的局部促炎微环境，持续激活破骨细胞前体。MAPK信号通路是连接炎症与骨代谢的核心通路，其过度激活可促进滑膜炎症和破骨细胞特异性转录程序。本研究中，落新妇苷通过多靶点调控MAPK信号通路，同时作用于SRC、STAT1、HSP90AA1、PTPN11等协同分子，全面抑制不同途径介导的MAPK过度激活。研究存在一定局限性：仅在动物组织层面进行检测，未开展体外破骨细胞和成纤维样滑膜细胞功能实验及MAPK3过表达/敲低救援实验，也缺少MAPK通路抑制剂对照组，因果证据尚不充分；MR分析全部基于欧洲人群遗传队列，与亚洲人群存在遗传多态性差异，外推受限；落新妇苷生物利用度和药代动力学数据尚待完善，未来需结合体外模型、纳米递送系统进行深入验证。
研究结论：落新妇苷可能通过调控MAPK信号通路发挥多种药理作用，包括抗炎、抑制破骨细胞活化、改善骨微结构和减轻RA骨破坏，并在体内表现出良好的安全性。该研究为RA骨破坏的靶向干预提供了新的分子靶点和候选天然活性分子。
