精浆小细胞外囊泡miRNA与代谢物的跨组学关联研究：特发性男性不育视角

《Frontiers in Endocrinology》：Cross-omics association of small extracellular vesicle miRNAs and metabolites in seminal plasma of idiopathic male infertility

　　

背景：特发性男性不育（idiopathic male infertility, IMI）占男性不育病例的30%–40%，但精浆功能障碍相关分子网络及非侵入性生物标志物仍不清楚。本研究旨在通过跨组学整合初步探索IMI精浆转录组与代谢组改变，并筛选代谢物中的探索性候选判别物。 方法：研究人员纳入30例IMI患者与30例正常精子浓度对照（normozoospermic controls, CG），进行精浆非靶向UHPLC-MS/MS代谢组学；候选差异代谢物经KEGG与基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）筛选，并对候选差异代谢物行Bootstrap内部验证的受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）分析。每组随机选10例分离鉴定精浆小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs；sp-sEVs），按国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）标准进行miRNA测序、靶基因预测、GO/KEGG富集、蛋白-蛋白互作（protein–protein interaction, PPI）网络构建，并在嵌套亚组中对失调miRNA与差异代谢物行Pearson相关分析。 结果：负离子与正离子电喷雾模式下分别鉴定68和152个候选差异代谢物；代谢扰动主要富集于不饱和脂肪酸生物合成，精氨酸与脯氨酸代谢通路在IMI中整体受抑；磷脂酸衍生物PA(i?15:0/18:1(12Z)?2OH(9,10))判别效能最佳，AUC为0.822（95% CI: 0.716–0.929）。sp-sEVs中鉴定128个差异表达miRNA（62上调和66下调）；靶基因功能富集提示蛋白磷酸化与胞内信号转导紊乱，磷脂酶D（phospholipase D, PLD）信号通路最显著，PIK3CA、PIK3R1与AKT1为核心枢纽基因；相关分析显示上调miRNA（hsa-miR-141-5p、hsa-miR-28-5p）与精浆中N-cis-11,14-eicosadienoyl ethanolamine呈正相关。 结论：IMI中sp-sEV miRNA与精浆代谢物存在协同改变；若干候选代谢物在本单队列中有判别价值但需验证；PLD通路可能参与，但因果未证实。

研究背景方面，特发性男性不育（idiopathic male infertility, IMI）指常规临床评估后仍无法明确病因的男性不育，占男性不育30%–40%。精浆（seminal plasma）由附属腺、附睾等分泌，占精液体积约95%，是精子成熟、能量供应与活力调节的直接微环境。已有研究提示精浆小分子量代谢物可反映附属性腺分泌功能并参与精子ATP供能、抗氧化防御及膜脂组成稳定；精浆小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs；sp-sEVs）可递送miRNA等活性分子调控生殖功能。然而，miRNA转录调控网络与代谢通路之间的系统整合分析仍然缺乏，因此研究人员设计嵌套多组学策略，在同期队列中联合非靶向代谢组学与sp-sEV miRNA测序，以揭示IMI精浆微环境改变并探索非侵入性生物标志物。

该研究论文发表于《Frontiers in Endocrinology》。研究人员共纳入30例IMI患者与30例正常精子浓度对照（normozoospermic controls, CG）构成代谢组学队列；再从该队列中各随机选取10例构成sp-sEV miRNA测序亚组。主要关键技术方法包括：精浆非靶向UHPLC-MS/MS代谢组学用于系统描绘代谢轮廓；按ISEV标准分离与鉴定sp-sEVs并进行miRNA转录组测序；基于miRDB的靶基因预测、GO/KEGG富集分析及Cytoscape构建蛋白-蛋白互作（protein–protein interaction, PPI）网络；在嵌套亚组内对top差异miRNA与候选差异代谢物行Pearson相关分析；并以PLS-DA、GSEA、ROC及Bootstrap内部验证支撑发现阶段分析。

研究结果如下。3.1节两组一般特征与精液参数显示，IMI组进行性活力、正常形态率更低，精子DNA碎片指数（DNA Fragmentation Index, DFI）与高DNA可染性（High DNA Stainability, HDS）更高，年龄、BMI、性激素与睾丸体积无显著差异。3.2节精浆非靶向代谢组学显示，ESI?与ESI+模式分别检出2123和2959个代谢特征；PLS-DA可清晰区分两组且置换检验提示模型未过拟合。候选差异代谢物中，ESI?模式68个，ESI+模式152个；KEGG富集提示ESI+模式不饱和脂肪酸生物合成显著扰动，GSEA显示精氨酸与脯氨酸代谢（MAP00330）整体受抑；ROC分析中PA(i-15:0/18:1(12Z)-2OH(9,10))的AUC达0.822，提示其作为辅助判别代谢物的探索价值。3.3节sp-sEV转录组显示，TEM、纳米颗粒分析与CD9/TSG101/Calnexin蛋白鉴定符合sEV特征；共鉴定1366个miRNA，其中128个差异表达（62上调、66下调）；靶基因GO富集集中于蛋白磷酸化与胞内信号转导，KEGG最显著为磷脂酶D（phospholipase D, PLD）信号通路，PPI网络核心枢纽基因为PIK3CA、PIK3R1与AKT1。3.4节miRNA-代谢物相关分析显示，校正后仅hsa-miR-141-5p与hsa-miR-28-5p同N-cis-11,14-eicosadienoyl ethanolamine在IMI组中保持显著正相关，其余多数名义相关经FDR校正后不稳健。

讨论部分总结为，IMI精浆呈现牛磺酸、L-苹果酸、L-赖氨酸下调及芥酸与多类磷脂酸（phosphatidic acid, PA）物种上调的代谢重塑，兼容氧化应激相关表型但未见直接氧化应激指标定量；sp-sEV miRNA靶基因富集于PLD信号，与代谢组检出的PA积累形成机制呼应，但PA还可经非PLD途径生成。多数miRNA-代谢物相关信号经FDR校正后消失，因此跨组学关联应谨慎解释。研究局限包括样本量较小、相关不等于因果、缺sp-sEV蛋白组、外源代谢物未系统鉴定、sEV表征仅每组1例等。

结论部分翻译为：研究人员在IMI中观察到sp-sEV miRNA与精浆代谢物的协同改变。若干候选代谢物在该单队列中显示出判别价值，但尚需验证。PLD通路可能参与上述过程，但因果关系尚未证实。