动物类型比生长阶段更能塑造畜禽粪便中活性抗生素抗性组

《Frontiers in Microbiology》：Animal type outweighs growth stage in shaping the active antibiotic resistome in livestock manure

　　

动物粪便（manure）是抗生素抗性基因（ARGs）的主要储库，然而调控其组成与活性的因素仍了解不足。该研究整合宏基因组学（metagenomics）、宏转录组学（metatranscriptomics）和定量聚合酶链反应（qPCR），表征五种动物类型、多个生长阶段粪便中的微生物群落与抗性组特征。结果显示，动物类型是决定DNA与RNA水平下微生物群落结构和ARG组成的主导因素，而生长阶段对整体群落结构无显著影响。宏基因组共鉴定944个ARG亚型，以四环素（tetracycline）、多重耐药（multidrug）和大环内酯-林可酰胺-链阳霉素（MLS）抗性为主；宏转录组检出579个活跃转录ARG亚型，其中29个（如tet(W)、sul1、erm(B)）在DNA与RNA水平均稳定检出，表明其处于活跃状态。被测动物中，蛋鸡垫料（layer litter）在DNA水平ARG数量最高，qPCR进一步显示blaTEM与erm(B)等特定ARG丰度显著更高。生长阶段虽对整体抗性组组成影响有限，但早期与幼年阶段部分ARG丰度更高。Procrustes分析显示微生物群落与抗性组在DNA和RNA水平均强相关，说明微生物组结构在ARG动态与活性中有关键作用。总体而言，动物类型是抗性组组成的主要相关因素，生长阶段主要关联特定ARG丰度变化；上述观察性结论尚需多场户纵向研究验证后方可用于管理或环境风险判断。

研究背景方面，全球畜禽养殖规模自21世纪以来快速扩张，畜禽粪便（livestock manure）作为有机肥源可提高土壤肥力，但兽药抗生素滥用使未代谢抗生素经排泄物进入环境，对土壤-植物系统产生选择压，推动抗生素抗性细菌（ARB）与抗生素抗性基因（ARGs）扩散。现有研究多聚焦单一粪型或单个生长阶段，且以DNA水平抗性组刻画为主，对转录层面活跃抗性组（active resistome）认识不足，也少有将动物类型与生长阶段作为驱动因素系统比较的工作。因此，研究人员在《Frontiers in Microbiology》发表该研究，旨在回答动物类型与生长阶段是否及如何驱动粪便中ARGs的组成与转录活性。

关键技术方法方面，研究人员在内蒙古呼和浩特五座商业化农场采样，涵盖猪、蛋鸡、羊、奶牛、肉牛，猪/蛋鸡/羊/奶牛取早期、幼年、育成、成年四阶段，肉牛取三阶段，每场同圈舍多只动物取三生物学重复并低温保存。随后以宏基因组学（metagenomics）表征DNA水平抗性组，以宏转录组学（metatranscriptomics）在去除核糖体RNA后表征RNA水平活跃抗性组，以定量聚合酶链反应（qPCR）绝对定量12个常见ARGs并以16S rRNA基因归一化，以ARGs在线分析流程（ARG_OAP3）比对SARG数据库、以综合抗生素抗性数据库（CARD）注释组装序列，以MetaPhlAn做分类注释，以主坐标分析（PCoA）、PERMANOVA、Procrustes分析评估群落与抗性组关系。

3.1 微生物组成（Microbial composition in animal manures）：通过宏基因组与宏转录组分类注释发现，DNA水平以厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、假单胞菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）为主，肠球菌属（Enterococcus）、Jeotgalibaca、乳杆菌属（Lactobacillus）为优势属；蛋鸡与猪粪中乳杆菌等富集。PCoA与PERMANOVA显示动物类型对微生物群落有显著效应（DNA水平R²=0.53，p=0.001），生长阶段无显著效应（R²=0.11，p=0.99）。RNA水平活跃菌属也主要由动物类型决定，单胃动物中Enterococcus、Limosilactobacillus、Lactobacillus转录活跃，反刍动物中Flavobacterium、Oceanisphaera等活跃，生长阶段主要改变部分菌属转录强度。

3.2 抗性组组成（Resistome composition）：宏基因组鉴定944个ARG亚型，以MLS、四环素、氨基糖苷抗性为主；tet(Q)、lnu(C)、tet(W)、aph(3′)-IIIa为优势亚型。宏转录组检出579个活跃ARG亚型，tet(W)、tet(Q)、lnu(C)、erm(B)、ugd等活跃。29个亚型在DNA与RNA水平共有，证明其为活跃抗性基因。PCoA显示动物类型显著塑造ARG组成（DNA水平R²=0.75，p=0.001；RNA水平R²=0.67，p=0.002），生长阶段不显著。蛋鸡垫料DNA水平ARG α多样性最高，猪次之，反刍动物较低。

3.3 ARG亚型与微生物群落α多样性（α-diversity of ARG subtypes and microbial communities）：DNA水平层粪Shannon与Chao1指数最高，猪次之，反刍动物相近；RNA水平层粪Shannon仍最高但Chao1无显著差异，说明动物类型改变转录多样性而非估计丰富度。微生物群落α多样性上，羊在DNA与RNA水平均最高，层与猪次之。

3.4 常见抗生素抗性基因定量（Quantitation of prevalent antibiotic resistance genes）：qPCR显示12个靶标绝对丰度为9.39×10⁵至2.93×10⁹ 基因拷贝/克干重，erm(B)最高。动物类型对bla_TEM、erm(B)、sul1、tet(Q)等影响显著，层粪中bla_TEM、erm(B)、erm(F)、sul1、sul2、tet(M)更高，羊粪中tet(Q)、tet(W)、tet(X)更高。生长阶段方面，早期与幼年阶段部分ARG相对丰度升高，juvenile阶段bla_TEM与tet(Q)较高，early-life阶段tet(M)较高。

讨论部分总结：研究人员指出单胃动物粪抗性组丰度与变异性高于反刍动物，层粪高α多样性可能与集约化笼养环境储库有关，猪粪四环素/氨基糖苷抗性突出与断奶后用药有关，反刍动物受瘤胃生态过滤与管理影响而抗性组较稳。生长阶段虽不改变整体抗性组结构，但早期/幼年个体ARG丰度更高，提示阶段特异性饲喂与粪污处理可作为缓解方向。Procrustes显示微生物群落与抗性组在DNA水平（M²=0.125，r=0.935，p=0.001）和RNA水平（M²=0.312，r=0.829，p=0.001）均强相关，RNA水平偏离更大，说明活跃抗性组还受微生物生理与环境压调控。研究人员也说明局限：每动物类型仅一农场导致场户混杂，生长阶段跨物种非生理等价，层粪读长水平宏转录ARG谱不可用，需多场户纵向研究验证。

结论部分翻译：动物类型被确定为在DNA与RNA水平塑造微生物群落和抗性组组成的主导因素，而生长阶段主要关联个别ARGs而非整体抗性组结构。此外，宏基因组与宏转录组分别检测到944和579个ARG亚型，但仅29个亚型在两水平共有。基于宏基因组，层粪在测试生长阶段中ARG亚型数量显著高于其他动物。微生物群落与抗性组组成之间的显著相关性表明，畜禽粪便中ARG模式由微生物群落演替决定。总之，畜禽粪便抗性组的解释与未来管理应区分动物类型间抗性组结构的广泛差异，与生长阶段中个别ARG丰度的变化。