酶预处理联合同步微波–超声辅助提取麦冬多糖的结构表征及抗氧化与益生元活性

《Frontiers in Microbiology》：Structural characterisation and antioxidant and prebiotic activities of Ophiopogon japonicus polysaccharides obtained by enzymatic pretreatment followed by simultaneous microwave–ultrasound-assisted extraction

　　

在本研究中，研究人员采用响应面法（response surface methodology, RSM）优化由酶预处理随后同步微波–超声辅助提取麦冬（Ophiopogon japonicus）多糖的两段式工艺。在未取整的模型最优条件（微波功率208.492 W、超声功率300.945 W、酶解时间25.207 min、微波–超声提取时间30.100 min）下，预测粗多糖提取率为43.999%（取整为44.0%）。经DEAE-52与Sephadex G-100层析获得两个组分OJP-1与OJP-2。结构分析显示二者在单糖组成、光谱性质、表面形貌、热稳定性及高效凝胶渗透色谱（high-performance gel permeation chromatography, HPGPC）分子量分布上存在差异。体外实验中，OJP-2比OJP-1表现出更强的自由基清除与益生菌促生长响应，而两组分在模拟消化体系中均抗水解。OJP-2的更强响应伴随其独特的组成、形貌、热学与HPGPC分子量分布特征。

研究背景方面，麦冬（Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker Gawl.）为天门冬科（Asparagaceae）植物，其干燥块根作中药用于滋阴润肺、生津止渴；现代药理研究提示其多糖具有抗氧化、调节肠道菌群、免疫调节及降血糖等潜力。植物多糖多为强极性大分子，常采用水提，但传统热水提取存在高温、耗时问题；超声辅助提取及超声辅助酶提取可提升效率，超声还可能改变多糖结构。不同原料与工艺条件下多糖结构与肠道菌群响应相关，菊糖（inulin）类底物具促益生菌生长作用。因此，研究人员有必要明确酶预处理后同步微波–超声辅助提取所得麦冬多糖的结构特征及其抗氧化与益生元活性。

主要关键技术方法上，研究人员以四川绵阳产麦冬根为原料，先以木瓜蛋白酶（papain）酶预处理，再于60 °C同步施加微波与超声提取，经离心、浓缩、80%乙醇沉淀得到粗多糖并以重量法计提取率；采用Box–Behnken设计（Box–Behnken design, BBD）与响应面法优化四因素。纯化上用Sevage法脱蛋白、2000 Da透析袋透析、DEAE-52纤维素柱与Sephadex G-100柱层析获OJP-1与OJP-2。结构表征用紫外–可见（UV–vis）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、HPGPC、PMP（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolinone）柱前衍生反相高效液相色谱分析单糖组成、刚果红试验、X射线衍射（XRD）、扫描电镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）与热重分析（TGA）。活性评价包括DPPH、ABTS、羟基自由基清除与还原力，人工唾液/胃液模拟消化，以及植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和混合菌的益生生长促进评价。

3.1 单因素实验分析

研究人员通过单因素实验考察微波功率、超声功率、酶解时间、同步微波–超声提取时间对粗多糖提取率的影响，发现微波功率约200 W、超声功率约300 W、酶解约25 min、提取约30 min时提取率较高，从而确定响应面设计水平。

3.2 响应面分析

研究人员以29组BBD实验拟合二次模型 Y = 43.95 + 0.81A + 0.24B + 0.35C + 0.21D ? 1.01AB ? 0.38 AC ? 0.34 AD ? 0.67 BC ? 1.12BD ? 0.28CD ? 4.54A²–5.46B²–3.70C²–4.02D²，模型极显著（F = 498.03，p < 0.0001），失拟不显著，R² = 0.9980。未取整最优预测提取率43.999%；取整条件（208 W微波、300 W超声、25 min酶解、30 min提取）下5次重复得43.57 ± 0.26%，与模型吻合且重复性好。

3.3 OJP分离纯化

研究人员经DEAE-52柱得三个组分，前两支经Sephadex G-100纯化得OJP-1与OJP-2；OJP-1为白色疏松层状，OJP-2为白色蓬松状，水洗组分OJP-1得率最高。

3.4 化学成分分析

研究人员测得两组分总糖高，考马斯亮蓝法与咔唑–硫酸法未检出蛋白与糖醛酸，提示为中性多糖。

3.5 结构表征

3.5.1 UV–vis与FT-IR：研究人员发现200–400 nm无260/280 nm特征吸收，FT-IR显示3410 cm^?1羟基、2930 cm^?1 C-H、1638 cm^?1结合水、1423 cm^?1糖环弯曲、1023 cm^?1吡喃环C-O相关峰。

3.5.2 HPGPC分子量：OJP-2主峰15.505 min（Mw = 1.8 kDa）为单峰；OJP-1双峰14.057 min（7.2 kDa）与16.430 min（0.7 kDa），呈双峰分布。

3.5.3 单糖组成：OJP-1以葡萄糖为主；OJP-2为葡萄糖:半乳糖:木糖 = 92.35:2.33:2.88，未检出糖醛酸。

3.5.4 SEM：两组分均不规则块状/片状聚集，OJP-2更疏松多孔，OJP-1局部更致密。

3.5.5 AFM：均为纳米丘状沉积，OJP-1最大高度24.6 nm，OJP-2为4.6 nm且分散更强。

3.5.6 三股螺旋：刚果红试验无显著红移，两组分均无三股螺旋结构。

3.5.7 XRD：2θ 15–30°宽漫射峰，无尖锐晶峰，属无定形结构。

3.6 热稳定性分析

研究人员经TGA/DTG发现30–120 °C为失水，200–350 °C为主链降解；OJP-1起始分解与最大失重温度略高于OJP-2，热稳定性更强。

3.7 抗氧化活性分析

3.7.1 ABTS：OJP-2清除能力强于OJP-1。

3.7.2 DPPH：4 mg/mL时OJP-1、OJP-2清除率79%、88%，EC₅₀分别为0.62、0.29 mg/mL，OJP-2更强。

3.7.3 羟基自由基：4 mg/mL清除率66%与73%，EC₅₀ 0.74与0.60 mg/mL，OJP-2更强。

3.7.4 Fe³⁺还原力：4 mg/mL吸光度1.1与1.5，OJP-2更高。四项抗氧化均以OJP-2响应更强。

3.8 模拟体外消化

研究人员在人工唾液pH 4–8与人工胃液pH 1–5中孵育6 h，OJP-1唾液水解最高4.89%、胃液最高2.40%；OJP-2唾液最高5.07%、胃液最高4.41%；两体系水解均低于5.07%，两 frac 均抗水解。

3.9 益生元特征

3.9.1 添加量对益生菌生长：0.5–2.0%促生长增强，2.0–2.5%平台，选2.0%。OD₆₀₀显示葡萄糖、FOS、OJP-1、OJP-2均促生长，趋势为植物乳杆菌 > 混合菌 > 嗜酸乳杆菌；OJP-2与FOS在植物乳杆菌和混合菌中无显著差异。

3.9.2 pH与乳酸：培养前期pH下降、乳酸上升，18 h后乳酸增速放缓；两组分均支持益生菌生长。

讨论部分总结：研究人员指出，酶预处理联合同步微波–超声辅助提取可获得高得率麦冬粗多糖，层析纯化得到结构不同的OJP-1与OJP-2；OJP-2较低分子量、葡萄糖为主但含半乳糖与木糖、疏松形貌与无定形特征与其更强抗氧化及益生元生长促进响应相伴。两组分在口胃模拟消化中稳定，提示其可能进入结肠被菌群利用。该研究为麦冬多糖作为功能成分的结构–活性关系提供了实验依据。

结论翻译：本研究采用响应面法优化了酶预处理联合同步微波–超声辅助提取麦冬多糖的两段式工艺。未取整模型最优预测粗多糖提取率43.999%；实用取整条件下5次重复得43.57 ± 0.26%，与拟合预测高度一致。OJP-1与OJP-2在单糖组成、微观形貌、热行为与HPGPC分子量分布上不同。两组分均具自由基清除与益生菌促生长活性，OJP-2响应始终更强；两组分在模拟消化体系中均抗水解。结果表明，OJP-1与OJP-2为结构不同的麦冬多糖组分，具体外抗氧化与益生菌促生长活性，其中OJP-2整体响应更强。论文发表于《Frontiers in Microbiology》。