植物乳植杆菌接种对玉米青贮发酵代谢、细菌群落功能与抗生素抗性组影响的宏转录组学解析

《Frontiers in Microbiology》：Metatranscriptomic insights into the effect of Lactiplantibacillus plantarum inoculation on fermentation metabolism, bacterial community function and antibiotic resistome of corn silage

　　

乳酸菌接种剂广泛用于青贮饲料生产；然而，植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）接种如何塑造青贮过程中微生物功能的时间变化，以及它是加速正常的演替过程还是与抗生素抗性组动态变化相关，目前仍不清楚。在本研究中，研究人员应用了一种整合的宏转录组学方法，结合微生物群落分析、差异表达分析、碳水化合物活性酶（CAZy）谱分析和抗性组表征，对接种L. plantarum的全株玉米青贮在新鲜材料（第0天）、发酵早期（第3天）和发酵后期（第90天）进行了分析。结果表明，接种与中心碳代谢基因的更高表达相关，包括第3天时ackA超过30倍的诱导表达和第90天时的44个差异表达基因，同时伴随更高的残余水溶性碳水化合物和减少的后期乙酸积累。氮相关基因表达经历了显著的时间重塑，从早期glnA和反硝化相关基因的广泛富集转变为后期参与亚硝酸盐同化的nirA的靶向富集。在LP处理青贮中，研究人员未检测到第3天至第90天之间CAZyme家族转录丰度的统计学显著时间差异，而对照组青贮中56.4%的家族随时间显著变化。已存在的核心抗性组以tet(C)、APH (3’)-Ia、bacA和tet(M)为主，合计占所有处理总ARG丰度的85%–94%。抗性组结构主要由发酵时间而非LP接种决定。值得注意的是，在测试条件下，LP驱动的基因表达变化并未增加活跃转录的抗生素抗性组，表明微生物群落发生了转变而未扩大检测到的抗性组谱。总体而言，这些结果表明，L. plantarum接种通过减少乙酸积累和保留水溶性碳水化合物改善了发酵特性，并与后期优势类群和功能基因转录的差异相关，但在受控实验室条件下并未增加活跃的抗生素抗性组。这些结果支持该接种剂在实验室规模青贮生产中的潜在应用，但仍需在不同饲草类型、菌株和田间条件下进一步验证。

一、研究背景与研究意义

青贮发酵是一个典型的资源受限生态系统：可发酵底物的逐渐耗竭与有机酸的积累共同形成能量和化学约束，随时间推移塑造群落组成、资源分配与功能格局。植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）是青贮生产中应用最广泛的接种剂之一，已有研究一致表明其可加速酸化、减少蛋白水解并改善干物质保存。然而，已有研究多基于培养法和16S扩增子测序，仅能反映发酵终产物和群落组成，而跨越整个青贮期（从高资源阶段到后期底物受限的稳定阶段）的代谢基因表达时间动态尚未通过宏转录组学加以研究。与16S rRNA测序和宏基因组功能潜能推断不同，宏转录组学能够捕获实际表达的基因，揭示微生物的转录响应，因此更适合研究发酵过程中基因表达的动态功能变化。

目前存在的关键问题包括：其一，L. plantarum接种是否在早期酸化之外维持中心碳代谢基因表达并改变底物利用进程；其二，接种是否随时间改变氮循环相关基因表达；其三，接种是否与对照相比降低碳水化合物活性酶（CAZy）谱的时间不稳定性；其四，接种是否改变抗生素抗性基因（ARG）的组成、表达模式或遗传多样性。为此，研究人员采用整合宏转录组学方法，对全株玉米青贮在新鲜材料（第0天）、发酵早期（第3天）和发酵后期（第90天）进行了系统分析，以确定接种是加速正常演替还是将发酵引导至不同的代谢状态。该论文发表在《Frontiers in Microbiology》。

二、主要技术方法

全株玉米（Zea mays L.）于半乳线期采自中国甘肃省武威市商业种植田，切碎至1–2 cm后分为对照（CK，喷施无菌蒸馏水）和LP（接种L. plantarum MTD1，1×10⁵ CFU/g鲜物质）两组，每组3个生物学重复，分别青贮3天和90天。RNA PowerSoil?Kit提取总RNA，去除rRNA后构建链特异性cDNA文库，于Illumina NovaSeq 6000平台双端测序（2×150 bp）。Kraken2/Bracken注释物种；MEGAHIT组装、MetaGeneMark预测ORF、CD-HIT构建非冗余基因集；Salmon定量转录本；DIAMOND比对KEGG/GO数据库，BLASTp比对CAZy数据库；ABRicate比对CARD数据库鉴定ARGs；pyDESeq2进行差异表达分析；R/Python完成统计。

三、研究结果

3.1 发酵品质与化学成分

pH受发酵时间、处理及其交互作用显著影响（P<0.001；P<0.001；P=0.007），LP处理青贮在第3天（3.92 vs 4.02）和第90天（3.45 vs 3.63）均低于对照。乳酸浓度随发酵时间显著增加，但处理间无差异。乙酸受时间（P=0.019）、处理（P=0.015）及交互（P=0.028）影响，对照在第90天显著高于LP处理（6.96 vs 2.83 g/kg DM）。乳酸/乙酸比率在两组间呈相反趋势：对照从14.01降至5.92，LP处理从6.28升至13.16，表明LP接种使后期发酵转向更同型乳酸发酵。LP处理WSC在第3天（225 vs 151 g/kg DM）和第90天（224 vs 197 g/kg DM）均高于对照。NH₃-N在第3天LP组高于对照（269 vs 211 g/kg TN），第90天无显著差异。丁酸随时间增加，干物质和粗蛋白均无处理效应。

3.2 微生物群落多样性与组成

基于Bray-Curtis距离的PCoA显示群落组成主要由发酵时间驱动（PERMANOVA R²=0.9951，P=0.001）；成对PERMANOVA经FDR校正后，第3天和第90天LP与对照间均无统计学显著差异，PERMDISP分析显示组内离散度无显著差异。第90天LP处理的Shannon（1.095 vs 0.830）和Simpson（0.337 vs 0.176）指数显著高于对照，Chao1无差异。新鲜材料以Weissella cibaria（36.6%）、Lactococcus lactis（22.6%）和Leuconostoc mesenteroides（11%）为主，三者至第3天均降至可忽略水平。第3天两组群落趋同，均以L. plantarum（