《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Integrated RNA-seq and ATAC-seq analyses reveal muscle development differences between european meat pigeon and shiqi pigeon during embryonic to post-hatching stages
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家禽肌肉生长和发育关键依赖于胚胎期和出壳阶段的骨骼肌形成。然而，不同鸽品种间早期胚胎肌肉发育差异仍不清楚。研究人员以体型不同的欧洲肉鸽和石岐鸽为模型，在胚胎第14天(E14)和出壳后第1天(P1)对两个品种的胸肌进行了ATAC-seq和RNA-seq分析。在P
家禽肌肉生长和发育关键依赖于胚胎期和出壳阶段的骨骼肌形成。然而，不同鸽品种间早期胚胎肌肉发育差异仍不清楚。研究人员以体型不同的欧洲肉鸽和石岐鸽为模型，在胚胎第14天(E14)和出壳后第1天(P1)对两个品种的胸肌进行了ATAC-seq和RNA-seq分析。在P1阶段，与欧洲肉鸽相比，石岐鸽具有显著更高比例的直径为1–50 μm的肌纤维、更高的肌纤维密度，并在各发育阶段以50–100 μm分布为主。整合ATAC-seq和RNA-seq分析揭示了由肌肉收缩、心脏调节通路和PI3K-Akt/肌肉重塑信号驱动的发育动态，以及品种间在染色体结构/细胞周期调控、癌症相关通路、代谢稳态和钙/雌激素信号方面的差异。此外，62个染色质可及性-基因表达共变差异表达基因(DEGs)(59个上调)富集于胰岛素受体结合和AMPK/cGMP-PKG通路；包括Sln、MYOM2、Trim63、Fabp3、ATP1A2、KLF15、IRS2和RYR3在内的关键基因的RT-qPCR表达与RNA-seq高度一致(r ≥ 0.8181)。本研究发现，在P1阶段石岐鸽胸肌肌纤维数量显著多于欧洲肉鸽。染色质可及性在转录起始位点附近高于其他区域。整合近端、远端和转录组数据，筛选并验证了关键候选基因。随后，通过组织表达谱验证了品种间差异表达的基因，并选择Sln进行功能研究。细胞和定量实验表明，Sln通过在上调增殖过程中的Myf5以及分化过程中的Myog和MyH1，正向调节鸽胚胎成肌细胞的增殖和分化。Western blot证实，与敲低组相比，Sln过表达组的MyoD和MyHC蛋白水平更高。本研究揭示了石岐鸽与欧洲肉鸽在胸肌肌纤维直径、胚胎染色质结构和基因表达方面的显著差异，为肌肉生长和发育的差异提供了分子见解。这些发现为理解不同鸽品种间的生长性能差异提供了理论基础，并为分子标记辅助育种奠定了基础。
**研究背景与意义**
中国肉鸽养殖业已形成全球最大生产规模，并正快速向规模化和自动化转型。石岐鸽是广东特色品种，成年公鸽体重418–734 g，母鸽321–701 g，乳鸽平均活重585.61 g；欧洲肉鸽Mimas品系为高产白羽品种，成年鸽700–750 g，28日龄乳鸽达610 g，具有突出的早期生长性能。总体上，石岐鸽体重较低、生长速度慢于欧洲肉鸽。鸟类胚胎期肌生成是决定产肉潜力的关键窗口，肌纤维数量在孵化前后基本确定，与肌肉质量密切相关。尽管先前转录组研究已鉴定出部分调控因子，但不同鸽品种间早期胚胎肌肉发育差异的分子机制仍不清楚。
为此，研究人员以体型差异显著的欧洲肉鸽和石岐鸽为模型，在胚胎第14天(E14)和出壳后第1天(P1)收集胸肌样本，开展组织形态学、转录组和表观基因组整合分析，旨在揭示品种间胸肌发育差异的染色质可及性与转录调控基础，筛选关键基因并进行功能验证。该研究系统探究了从胚胎期至出壳后胸肌发育的分子调控机制，为理解不同体型鸽品种的生长性能差异提供理论基础，并支持分子标记辅助育种的应用。该论文发表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。
**关键技术方法**
研究人员从欧洲肉鸽和石岐鸽各取E14和P1两个时间点的胸肌组织，每品种每阶段3个生物学重复，共12只个体。主要技术方法包括：H&E染色观察肌纤维形态；ATAC-seq测序全基因组染色质可及性；RNA-seq测序转录组；整合差异可及区域与差异表达基因，结合GO和KEGG富集分析筛选候选基因；RT-qPCR验证候选基因表达；通过组织表达谱筛选目标基因；在分离的鸽胚胎原代成肌细胞中，采用过表达和RNA干扰技术进行功能研究，并通过EdU染色、免疫荧光和Western blot评估细胞增殖与分化。
**研究结果**
**4.1 两个鸽品种胸肌H&E染色结果分析**
通过H&E染色及形态计量分析，研究人员发现石岐鸽在P1阶段具有显著更高比例的1–50 μm直径肌纤维和更高的肌纤维密度，而欧洲肉鸽以50–100 μm直径分布为主。这提示两品种在胚胎期胸肌发育模式上存在显著差异。
**4.2 转录组分析揭示与鸽胸肌发育相关的关键基因和通路**
对12个样本进行RNA-seq，差异表达分析鉴定出755个品种相关DEGs和1118个阶段相关DEGs。GO/KEGG富集分析显示，发育阶段相关基因显著富集于肌肉收缩功能（如肌球蛋白磷酸酶活性、钙依赖性ATPase活性）和心脏调节通路（如肥厚型/扩张型心肌病、心肌收缩）；品种间差异基因则富集于染色体结构/细胞周期调控、癌症相关通路、代谢稳态和钙/雌激素信号，表明品种差异涉及基因组完整性与增殖代谢的协同调控。
**4.3 ATAC-seq分析揭示胸肌发育过程中的动态染色质可及性变化**
ATAC-seq数据显示，开放染色质峰主要分布在转录起始位点(TSS)附近，尤其在TSS上游和下游2 kb区域富集，且生物学重复间相关性高。发育阶段相关的可及区域富集于肌肉功能与重塑通路，包括肥厚型心肌病、心肌收缩、PI3K-Akt信号等；品种间差异可及区域则富集于染色体组织、细胞周期和增殖相关过程。结果说明，胸肌发育伴随染色质可及性的动态重塑，品种差异可能源于染色质结构的种间特异性。
**4.4 整合ATAC-seq和RNA-seq分析揭示调控肌肉发育的候选基因**
整合分析鉴定出62个染色质可及性与基因表达共变的DEGs，其中59个上调、3个下调。这些基因富集于胰岛素受体结合、AMPK信号、cGMP-PKG通路等。转录因子富集分析提示ZNF189、NR3C2、NR3C1、PGR及MEF家族成员可能参与调控，并在可及区域中鉴定到保守DNA结合基序，说明特定转录因子结合事件可能介导品种特异性肌肉发育调控。
**4.5 关键肌源基因的验证**
研究人员选择Sln、MYOM2、Trim63、Fabp3、ATP1A2、KLF15、IRS2和RYR3共8个基因进行RT-qPCR验证。结果显示这些基因在不同品种或发育阶段的表达趋势与RNA-seq结果高度一致（相关系数r≥0.8181），确认了转录组数据的可靠性。
**4.6 Sln对鸽胚胎成肌细胞增殖和分化的影响**
通过过表达和RNA干扰技术调控Sln表达，EdU染色显示Sln过表达显著提高EdU阳性细胞率，干扰则降低该比率，表明Sln促进成肌细胞增殖。RT-qPCR显示Sln过表达上调Myf5表达，干扰则抑制Myf5。在分化阶段，MyHC免疫荧光显示Sln过表达促进肌管融合，干扰则减少肌管形成；同时Sln过表达上调Myog和MyHC，干扰则下调。Western blot证实Sln过表达组MyoD和MyHC蛋白水平高于对照组和干扰组。这些结果表明Sln通过Myf5（增殖期）和Myog、MyH1（分化期）正向调控鸽成肌细胞的增殖与分化。
**讨论与结论**
讨论部分指出，较小体型品种往往具有更高的胚胎期肌纤维密度或更快的肌肉发育速率，这一跨物种保守模式与本研究相符。石岐鸽在P1阶段肌纤维密度显著高于欧洲肉鸽，可能为其出生后的肌肉生长轨迹奠定细胞学基础。整合多组学分析发现，多个候选基因可能通过长距离调控机制参与肌肉发育，例如MEF2和FOX家族蛋白结合位点。已验证的基因如Fabp3、KLF15、IRS2、ATP1A2、TRIM63和RYR3均与肌细胞增殖分化、代谢或肌肉蛋白周转相关。Sln因在胚胎期品种间表达差异显著且仅在肌肉组织高表达而被选为关键基因，功能实验确认其促进成肌细胞增殖和分化。研究局限性包括仅分析特定时间点、未完全覆盖动态发育全过程，以及转录因子与下游基因的直接调控关系尚需实验验证。应用上，筛选出的关键基因可为肉鸽分子标记辅助选择提供基础，并结合基因编辑等技术优化体型和生长速率。
综上，石岐鸽在P1阶段的胸肌肌纤维密度显著高于欧洲肉鸽。整合RNA-seq和ATAC-seq分析鉴定了62个候选基因和若干调控早期成肌基因表达的通路。对8个选定基因（Sln、MYOM2、Trim63、Fabp3、ATP1A2、KLF15、IRS2、RYR3）的RT-qPCR验证与转录组结果一致。在肝脏、肠道、心脏、胸肌和腿肌中的组织表达谱分析筛选出Sln进行功能验证。细胞和定量数据表明，Sln通过Myf5（增殖）和Myog/MyH1（分化）正向调节鸽成肌细胞的增殖和分化。Western blot分析进一步证明Sln调节MyoD和MyHC等成肌因子的蛋白表达。本研究揭示了不同体型鸽品种间胚胎染色质可及性和基因表达差异，为阐明不同体型鸽骨骼肌发育的分子机制提供了理论基础，并支持未来的分子标记辅助育种。
